[发明专利]叶酸受体靶向超声造影纳米微泡的制备方法

权利要求书

1.一种叶酸受体靶向超声造影纳米微泡的制备方法，该纳米微泡由核心模板和外壳构成，其特征在于所述的核心模板为液态氟碳纳米乳化剂，所述的外壳为叶酸接枝聚乙二醇化壳聚糖衍生物，

所述的液态氟碳纳米乳化剂包括如下组分及质量体积百分比浓度：

全氟辛溴烷  2.895％～4.825％；

甘油   2.25％～2.5％；

泊洛沙姆  1880.4％～0.8％；

油酸   0.15％～0.25％；

蛋黄卵磷脂  2.2％～2.6％；

其余为水，

包括如下步骤：

①将甘油、泊洛沙姆188、油酸、蛋黄卵磷脂及超纯水混合配成乳化剂混悬液，将全氟辛溴烷加入到乳化剂混悬液涡旋混合后，在超声波作用下，形成核心模板材料；

②配置叶酸接枝聚乙二醇化壳聚糖衍生物，形成外壳材料；

③将核心模板材料逐滴加入到外壳材料中并磁力旋转搅拌，离心，纯化水洗，灭菌，过滤，得到产物；

所述超声满足如下条件：超声用时5～15分钟，超声启动5～15秒，间隔时间5～15秒，超声温度20～30℃。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤①中所述的核心模板材料通过如下步骤制得：

将甘油、泊洛沙姆188、油酸及蛋黄卵磷脂涡旋混合于超纯水中形成混悬液，该混悬液在30～40℃条件下孵育0.5～1.5小时，形成乳状液；再涡旋混合下逐滴加入全氟辛溴烷，定容，超声，离心，获得纳米乳化剂。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤②中所述的外壳材料通过如下步骤制得：

将叶酸250～300mg、N,N'-二环己基碳二亚胺230～250mg、N-羟基丁二酰亚胺120～150mg共同溶解于二甲基亚砜5～6ml中，20～30℃下反应6～8小时，生成叶酸活性酯，过滤去除沉淀，备用；

将α-羧基-ω-氨基聚乙二醇0.8～1.2g添加到上述的叶酸活性酯中，形成羧基-聚乙二醇-叶酸；

将羧基-聚乙二醇-叶酸在无水嘧啶中孵育2～4小时，透析24～30小时，超纯水透析48～50小时；过滤去除不溶物，冰冻干燥获得产物羧基-聚乙二醇-叶酸；

将壳聚糖200～250mg溶解于重量百分比为2％的醋酸水溶液20～25ml中，获得壳聚糖醋酸水溶液，备用；

将羧基-聚乙二醇-叶酸200～250mg、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐20～25mg、N-羟基丁二酰亚胺10～15mg溶解于二甲基亚砜中，预激活4～6小时，然后逐滴加入到前述的壳聚糖醋酸水溶液中，暗室中搅拌20～24小时直至反应完成，生成的产物超纯水透析72～80小时，脱水，冷冻真空干燥制得叶酸-聚乙二醇-壳聚糖干粉；

用无水乙醇配制浓度为10mg/ml的异硫氰酸荧光素溶液10～15ml，嫁接于合成的叶酸-聚乙二醇-壳聚糖作为荧光示踪剂，2％醋酸水溶液配制浓度为4～6mg/ml的叶酸-聚乙二醇-壳聚糖，磁力搅拌下将上述异硫氰酸荧光素溶液逐滴加入到上述步骤制备的叶酸-聚乙二醇-壳聚糖的醋酸水溶液中，避光反应2～3h，使两者结合完成荧光标记，pH调整为9.0，离心去除上清，2％醋酸水溶液重悬至20ml，重复多次离心至上清无色，最后用1％的醋酸水溶液重悬沉淀，4～6℃叶酸-聚乙二醇-壳聚糖避光保存备用。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述步骤③如下：

取制备的异硫氰酸荧光素-壳聚糖-聚乙二醇-叶酸醋酸水溶液用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至5.5～6.5，取核心模板材料2～3ml，磁力搅拌下缓慢滴加入异硫氰酸荧光素-壳聚糖-聚乙二醇-叶酸醋酸水溶液中，搅拌，36～38℃孵育25～35mim，15000rpm～16000rpm高速冷冻离心，沉淀超纯水清洗，灭菌，过滤去除杂质。