[发明专利]叶酸受体靶向超声造影纳米微泡的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种靶向纳米微泡的制备方法，该纳米微泡可以通过被动和主动两种靶向效应准确定位到叶酸受体高表达的肿瘤细胞，并被肿瘤细胞摄取，从而实现该肿瘤细胞的特异性超声分子成像，属于医疗药物领域。

背景技术

超声检查由于其无创无辐射、操作方便、价格低廉、对设备场地要求低等优势，是临床诊断肿瘤的重要手段，超声造影在多年的临床应用中已经证实在肿瘤的检出和定性诊断中有着重要的意义。超声造影优于常规造影，与CT、MRI相比拥有更多的优越性。安全高效的超声造影剂是超声造影的基础与关键，目前临床常用的是二代微泡造影剂Sono Vue即脂质微泡造影剂，但长期的临床实践发现其对肿瘤组织的特异性不强，对病变组织缺乏亲和力，并且由于微泡粒径大多集中在2～10μm范围内(平均粒径为3～5μm)，而毛细血管内皮间隙约为380～780nm，因此微米级微泡是无法穿透血管内皮间隙而到达肿瘤组织中，实际为微血管的非特异性显影，缺乏血管外肿瘤组织细胞的特异性；尽管多数肿瘤的血供丰富，然而对于乏血供的肿瘤就容易漏检，这大大限制了声学显像对于肿瘤鉴别诊断的效能。

近来研究者们开始了靶向超声微泡(第三代微泡造影剂)的研究，靶向超声造影剂是将特异性抗体或配体连接到声学造影剂表面，依靠抗原-抗体/配体-受体之间特异性识别并结合，通过血液循环积聚到带有相应抗原/受体的靶器官或靶组织，从而使器官或组织在超声检查中得到特异性增强。与普通微泡相比，靶向超声造影通过特异性作用于病变区生物分子组成成分，来突出显示病变部位，从而提高超声诊断的准确性与敏感性。

研究表明，肿瘤细胞膜表面或肿瘤供应血管表面存在着一些受体并在肿瘤组织中存在异常表达，与相应配体或配体类似物能特异结合。受体与配体的结合具有特异性、选择性、饱和性、亲合力强和生物效应明显的特点，为肿瘤的靶向诊治提供了靶向途径。其中叶酸受体(folate receptor,FR)是目前研究较多的一种，其是一种糖基化磷脂酰肌醇(GPI)连接的膜糖蛋白，与叶酸(FA)具有高亲和力，可通过受体介导的内吞作用将叶酸(FA)摄入细胞胞浆。叶酸受体(FR)在正常组织中的表达高度保守，FRα主要在上皮细胞系肿瘤(如卵巢癌、结直肠癌、子宫内膜癌、睾丸癌、脑瘤、肺腺癌等)中高水平表达。虽然在正常细胞中FR可选择性的表达在细胞表面但是其呈极性分布，血液循环中的靶向制剂不能接近该受体，亦不能进入正常细胞，而恶性肿瘤细胞中FR分布失去极性，血液循环中的靶向制剂可接触该受体。与大分子抗体相比，叶酸(FA)属于小分子物质，FA-FR的配体/受体结合具有高亲和力(Kd＝10-10mol/L)，化学性质简单，易于修饰，体积小(Mr＝441.4)，高度化学稳定性和生物学稳定性，与有机溶剂的生理相容性，低免疫原性，达到靶点时间短、血液清除速度快、穿透能力强、低成本等诸多优点，使得FA成为肿瘤诊断和治疗理想的靶向载体之一，并且FA的靶向作用已经在核素PET-CT、MRI的靶向显像中得到证实。

经检索，利用有序超分子膜层层自组装原理，构建叶酸受体介导的靶向纳米超声造影剂未见文献报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对上述的技术现状而提供一种新型应用于肿瘤细胞超声分子成像的叶酸受体靶向超声造影纳米微泡的制备方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种叶酸受体靶向超声造影纳米微泡的制备方法，该纳米微泡由核心模板和外壳构成，其特征在于所述的核心模板为液态氟碳纳米乳化剂，所述的外壳为叶酸接枝聚乙二醇化壳聚糖衍生物，

所述的液态氟碳纳米乳化剂包括如下组分及质量体积百分比浓度：

全氟辛溴烷 2.895％～4.825％；

甘油  2.25％～2.5％；

泊洛沙姆188  0.4％～0.8％；

油酸  0.15％～0.25％；

蛋黄卵磷脂  2.2％～2.6％；

其余为水，

包括如下步骤：

①将甘油、泊洛沙姆188、油酸、蛋黄卵磷脂及超纯水混合配成乳化剂混悬液，将全氟辛溴烷加入到乳化剂混悬液涡旋混合后，在超声波作用下，形成核心模板材料；

②配置叶酸接枝聚乙二醇化壳聚糖衍生物，形成外壳材料；

③将核心模板材料逐滴加入到外壳材料中并磁力旋转搅拌，离心，纯化水洗，灭菌，过滤，得到产物；