[发明专利]粉大蕉枯萎病菌的二重PCR分子快速检测方法

说明书

技术领域

本发明属于农作物病害防治及植物检疫技术领域，具体地，涉及一种粉大蕉枯萎病菌的二重PCR分子快速检测方法。

背景技术

香蕉枯萎病是香蕉的毁灭性病害，也是重要的检疫性病害。香蕉枯萎病发生在我国香蕉主产区，对我国香蕉产业构成了毁灭性威胁，也影响了香蕉产区农民的经济收入，阻碍了社会主义新农村建设的进程。香蕉枯萎病菌以带菌土壤和种苗传播，病菌的快速、准确检测对预防病害扩散有重要意义。香蕉植株及土壤的带菌检测是香蕉枯萎病的早期诊断和病害监测的关键指标。

近年来，随着香蕉枯萎的发生、蔓延及病原菌的变异演化，我国的大蕉也开始发生枯萎病，严重的地块发病率达30％以上。相关研究表明，引起大蕉枯萎病的病原菌主要是1号生理小种或者是与1号生理小种亲缘关系较近的一个新的系统发育谱系，该谱系可能为1号生理小种变异演化而来(吕顺等，2014)。目前我国已经有利用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术，或香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种特有的致病相关基因序列设计引物(李敏慧等，2012)，发明了用于检测香蕉枯萎病4号小种(race 4)或1号小种(race 4)的PCR快速检测技术的报道，但是香蕉枯萎病4号小种或1号小种存在较大的遗传分化，目前建立的分子快速检测方法主要是针对国内某地区的生理小种建立起来的，仅利用已建立个别引物进行快速检测可能对小种内某些分化类群无法检测出。这可能会引起假阴性现象，导致对实验结果的错误判断。此外，我国目前还未有针对大蕉枯萎病的分子快速检测方法。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种粉大蕉(粉蕉及大蕉)枯萎病病原菌的二重PCR分子快速检测方法，该方法提供的分子快速检测引物不仅可以对大蕉枯萎病菌进行检测，也可以对广东地区的粉蕉枯萎病优势菌群进行检测，具有操作简便，耗时少，灵敏度高等优点；另外，通过该技术对粉大蕉种苗、种植区土壤浸提液、灌溉水等进行检测，防止大蕉枯萎病的扩散与蔓延，对于确保我国香蕉无病种苗生产基地的建设、确保香蕉安全生产具有重要意义。

本发明所述粉大蕉枯萎病病原菌的二重PCR分子快速检测方法从大蕉枯萎病菌特有的基因序列入手，针对大蕉枯萎病菌两个不同的分化类群设计了两对特异引物，该引物可同时对大蕉枯萎病菌2个不同分化类群进行检测；同时，由于大蕉枯萎病菌的类群2与广东地区的优势1号小种(粉蕉枯萎病菌)类群遗传基因相同，因此，该检测方法也可以对广东地区的粉蕉枯萎病优势菌群进行检测。该方法操作简便易行，可以以试剂盒的形式直接应用于生产实践，用于带菌的植物组织或土壤的高灵敏度快速检测，确保为生产提供健康无菌种苗、对病原菌分子预警具有十分重要的意义。

本发明的技术方案如下：一种粉大蕉(粉蕉及大蕉)枯萎病菌的二重PCR分子快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)设计粉大蕉枯萎病菌类群1和类群2特异引物，引物序列如下：

(2)对样本进行处理，抽提样本DNA；

(3)以样本DNA为模板，使用粉大蕉枯萎病菌类群1和类群2特异引物进行二重PCR扩增反应；

(4)用1.2％-1.5％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，当PCR产物呈现755bp的扩增条带时，即表明样本中含有大蕉枯萎病菌，PCR产物呈现590bp的扩增条带时，表明样本中含有粉蕉或大蕉枯萎病菌。

步骤(2)中所述的样本为粉大蕉病原菌，所述抽提样本DNA为利用改进的SDS法提取的真菌菌丝的DNA。

步骤(2)中所述的样本为香蕉植株组织，所述抽提样本DNA为利用CTAB法抽提香蕉植株组织中的DNA,所选取的香蕉组织部位为香蕉根、球茎或假茎组织。

步骤(2)中所述的样本为土壤时，所述抽提样本DNA优选为使用土壤基因组DNA快速提取试剂盒提取疑感染的土壤DNA。

步骤(3)所述的二重PCR扩增反应的反应条件优选为94℃预变性5min；94℃变性1min，65℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min；

步骤(3)所述的二重PCR扩增反应的体系(50μL)如下：

步骤(4)所述的用琼脂糖凝胶电泳检测优选用1.2％-1.5％(w/v)琼脂糖凝胶电泳检测。

所述的粉大蕉枯萎病菌二重PCR分子快速检测方法在检测粉蕉及大蕉枯萎病菌的应用。