[发明专利]一种制备恩拉霉素精粉的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种制备恩拉霉素精粉的方法，属于工业生物技术，多肽类抗生素分离纯化领域。

背景技术

恩拉霉素(Enramycin)是由土壤中分离出来的放线菌Streptomyces fungicidious  NO.B5477发酵产生的一种多肽类抗生素。由13个不同种类的17个氨基酸分子和不饱和脂肪酸分子组成，其中16个氨基酸形成了大环内酯肽，另一个N端与顺、反武脂肪酸链酰化成环状缩酚酸肽，根据化学结构中脂肪酸侧链的不同，可将其分为A（C₁₀₇H₁₃₈C_l2N₂₆O₃₁）和B（C₁₀₈H₁₄₀C_l2N₂₆O₃₁） 两种。其在厌氧和有氧的条件下，对革兰氏阳性菌都有显著的抑制作用。至今尚未发现对恩拉霉素产生耐药性的细菌，恩拉霉素与其他抗生素和抗菌药之间也无交叉耐药性。恩拉霉素添加在动物饲料中，能改变肠道内的菌群平衡，增加饲料中营养物质的吸收利用，内服时在肠道内不吸收，主要通过粪便排出体外，因而不会产生药物残留问题。因此，恩拉霉素被世界上许多国家推荐作为一种饲料中安全的抗生素促生长剂来使用。

随着恩拉霉素越来越广泛的应用，同时恩拉霉素的稳定性较差，容易分解，因此分离纯化得到稳定的恩拉霉素精粉成为一个重要课题。 

抗生素提取主要有以下几种途径：有沉淀法、溶媒萃取法、吸附法、离子交换树脂法、高效液相色谱法、膜分离技术、毛细管电泳、双水相技术、反胶束、超临界萃取等。其中膜分离技术、毛细管电泳、双水相技术、反胶束、超临界萃取等为近几年新开始应用的方法，成本高，没有较为成熟的工业化模式，大多在实验室小规模对个别品种进行探索。

沉淀法、溶媒萃取法、吸附法等传统方法，由于活性炭和大多数溶媒不能很好的将杂质分离得到的物质纯度不够，目前大多应用于粗提，粗品预处理阶段，配合其他方法共同应用。目前大多数抗生素品质在分离、提取、浓缩、纯化、脱色等方面广泛应用的是色谱法。

中国发明专利《一种安来素产生菌及利用大孔树脂提取的方法》（专利号：ZL200910032340.1）中记载用大孔吸附树脂安伯莱特XAD-4、安伯莱特XAD-16等来分离提取恩拉霉素。该发明方法对于菌丝体中恩拉霉素的产率只能控制在60-71%，回收率低，对于规模化工业生产损耗太多，含量检测方面也难满足准确度的要求。中国发明专利《使用大孔弱酸性阳离子树脂分离提取恩拉霉素的方法》（专利号：ZL 201010213986.2）中记载了一种恩拉霉素分离纯化的方法，该发明方法使用大孔弱酸性阳离子树脂在碱性条件下分离提取恩拉霉素，得到的纯度较高的产品稳定性较差，容易降解。因此需要一种既能提高恩拉霉素纯度的又能保证其品质稳定的精粉制备方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种制备恩拉霉素精粉的方法，该方法通过先升温后降温的方法收集收集恩拉霉素菌丝体，采用混合溶液浸提，最后使用大孔弱酸性阳离子交换树脂分离提取，操作简单，所得恩拉霉素精粉纯度高，稳定性好。

一种制备恩拉霉素精粉的方法，步骤如下：

（1）恩拉霉素发酵液先升温至70℃，灭活30min，灭活后降温至40-45℃，再依次添加两种絮凝剂进行絮凝，处理完的发酵液进行板框过滤收集恩拉霉素菌丝体；

（2）恩拉霉素菌丝体用菌丝体浸提液进行浸提得到恩拉霉素浸提液；

（3）将恩拉霉素浸提液经大孔弱酸性阳离子交换树脂吸附，用0.5mol/L盐酸水溶液处理树脂，并平衡柱子，用2mol/L氢氧化钠溶液将恩拉霉素浸提液的pH值调至5.5，以1ml/min速率上样，待流出液pH为5.3时不再上样，改用2个柱体积的pH5.5的水溶液平衡柱子，再用0.5mol/L盐酸水溶液洗脱，收集洗脱液；

（4）将滤液通过真空浓缩的方式去除丙酮和过多的水分，温度控制在50-90℃，浓缩至滤液原体积的1/30-1/10，收集浓缩液；

（5）用碱溶液将浓缩液的pH值调至7-9，得到恩拉霉素晶体；

（6）反复用无菌纯水和丙酮洗涤除去杂质，再干燥，即得恩拉霉素精粉。

步骤（1）中第一种絮凝剂为质量浓度为0.5%的壳聚糖溶液，用量为每立方米恩拉霉素发酵液添加0.5kg壳聚糖溶液；第二种絮凝剂为质量浓度为0.1%的聚丙烯酸钠溶液，用量为每立方米恩拉霉素发酵液添加0.05-0.08kg聚丙烯酸钠溶液。