[发明专利]从干燥杏叶片中提取DNA的方法

权利要求书

1.一种从干燥杏叶片中提取DNA的方法，其特征在于下列步骤：

(1)去除杏叶的叶柄，称取20mg叶片，加入0.001克的PVP-40T，加入液氮，将叶片研磨成细粉末状，将细粉末加到2.0mL的离心管中；

(2)加入1mL预冷的缓冲浸提液，混匀后冰浴15分钟，冰浴过程中颠倒混匀2-3次；

(3)在7000g下离心10min，弃上清；

(4)重复步骤(2)和(3)，直至上清不黏稠；

(5)每管迅速加入0.8mL预热至沸腾的CTAB Buffer，混匀，65℃水浴0.5-1h，间隔15min摇匀一次；

(6)加入0.01mL 100mg/L RNase，37℃水浴30–60min；

(7)取出后冷却至室温，每管加入0.8mL的体积比为25:24:1的苯酚：氯仿：异戊醇，4℃保存，轻轻颠倒充分混匀15分钟，室温下10000g离心10min；

(8)吸上清并置于新的2.0mL离心管中，加入0.7mL的氯仿：异戊醇按体积比为24：1的氯仿异戊醇溶液，颠倒混匀15分钟，10000g离心10min，置于另一1.5mL离心管中；

(9)加入0.5mL-20℃预冷的异丙醇，轻轻混匀后-20℃垂直放置30min；

(10)在10000g离心10min，弃上清，再短暂离心收集剩余液体，用移液枪吸除剩余液体；

(11)加入0.5mL 75％浓度的乙醇溶液，轻轻弹起沉淀，在10000×g离心2min，弃上清；

(12)重复步骤(11)；

(13)风干乙醇，加入0.1mL TE溶解DNA；

(14)测定DNA的浓度和纯度，得到DNA样品；

相关试剂及配制方法如下：

(1)母液配制：

1)1000.0mL1.0mol/LTris-HCl，pH8.0，母液：

称量Tris 121.10g，加入500.0mL双蒸水溶解，用1.0mol/L HCl调pH至8.0，定容至1000mL，混匀，灭菌，4℃保存；

2)500.0mL 5.0mol/L NaCl母液：146.00g NaCl用双蒸水溶解、定容至500.0mL，混匀，灭菌，4℃保存；

3)500.0mL 0.5mol/L EDTA母液：93.05g Na₂EDTA·H₂O加350.0mL双蒸水溶解，10.0mol/L调pH至8.0，定容至500.0mL，混匀，灭菌，4℃保存；

4)250.0mL 3.0mol/L NaAc，pH5.2-5.3，母液的制备：

取102.00g NaAc·3H₂O，用少量双蒸水溶解，用3.0mol/L乙酸调pH至5.2，定容至250.0mL，混匀，灭菌，4℃保存；

(2)相关试剂的配制：

1)100.0mL，2％浓度的CTAB Buffer的配制方法：

称取CTAB 2.00g，偏重亚硫酸钠0.10g，PVP 1.00g，加入1.0mol/L Tris-HCl 10.0mL，5.0mol/L NaCl 30.0mL，0.5mol/L EDTA 10.0mL，混匀后加双蒸水至100.0mL，煮沸，提取前趁热迅速加2mLβ-巯基乙醇，混匀；

2)TE缓冲液，pH8.0，10.0mmol/L Tris-HCl，1.0mmol/L EDTA；

3)pH8.0的100mL TE缓冲液配制方法：1mL 1mol/L的Tris-HCl和200μL 0.5mol/LEDTA混匀后定容至100.0mL，混匀，灭菌，4℃保存；

(3)缓冲液配制：

1.缓冲浸提液配方，100mL

2.权利要求1所述的方法在干燥杏叶片中提取DNA中的应用。