[发明专利]从干燥杏叶片中提取DNA的方法

说明书

技术领域

本发明属于植物总DNA制备技术领域，具体涉及一种从干燥杏叶片中提取DNA的方法。

技术背景

在野外采集的植物叶片要经过长距离运输和保存，不论幼嫩的叶片或成熟的叶片通过硅胶干燥后，虽叶片迅速失水，但在植物叶片组织中还含有大量的多糖、多酚、蛋白和酯类等植物次生代谢产物及降解的DNA，这使得提取DNA的产率、质量和难易程度与用新鲜叶片材料提取有着很大的差异。

DNA是遗传信息的载体、是植物的基本遗传物质。高质量的DNA样品是进行限制性酶切、PCR扩增、分子杂交、遗传多态性分析以及基因组学等分子生物学研究的物质基础。植物DNA的提取方法有很多，传统的方法有CTAB法(Doyle and Doyle,1987)、改良CTAB法(程运江等，2001)，SDS法(蔡朝辉等，2000)，改良的植物DNA提取方法(周世良等，2013)。这些方法都是在裂解植物细胞的基础上，多次利用有机溶剂抽提，使得蛋白质等溶解在有机溶剂里，而核酸保留在水相里，最终达到分离核酸的目的，这也是目前应用最为广泛的DNA提取方法。另外，国内外生物公司开发了多种商品化的植物DNA提取试剂盒，不同的DNA提取试剂盒分离DNA的原理也不同，由于植物DNA提取试剂盒具有快速、方便、无需苯酚、氯仿避免了有机溶剂污染等优点，在条件允许的情况下通常被采用，但使用试剂盒提取干燥杏叶片DNA效果并不好，难以满足PCR扩增、分子杂交、遗传多态性分析的后续研究。

我国是杏属植物的原生起源地，特别是新疆地区，有着悠久的栽培历史和丰富的遗传多样性。对杏资源进行资源调查和遗传多样性研究时，野外采集标本和样品的路途远、时间长，因此常常采用硅胶干燥的方法保存和运输植物组织。植物中次生代谢产物的种类和含量差异很大，有时同种植物器官或组织不同状态的次生代谢产物的种类和含量也不一样，针对某个物种优化的DNA提取方法不一定适用于其它物种，因此获取高质量杏叶片中的DNA有一定的困难。传统的CTAB法是目前应用最广泛的DNA提取方法，但是该方法在提取杏植物干燥叶片时，残留了大量的蛋白糖类物质，影响到后续的PCR扩增、遗传多态性分析研究。迄今，还未见针对干燥杏叶片中提取高质量DNA的研究报道。

发明内容

本发明的目的在克服现有技术的缺陷，提供一种从干燥杏叶中高质量提取DNA的方法。

本发明的技术方案是：首先进行叶片组织中的次生代谢物质的抽提，用预冷缓冲浸提液对碾磨好的干杏叶冰浴、离心、弃上清，反复浸提数次，有利于将杏叶中多糖、多酚、酯类等次生代谢物在DNA释放前将其除去，防止与DNA形成复合体；在液氮碾磨和缓冲浸提液处理时，加入适量的PVP-40T，保护了DNA免受氧化,促进了细胞裂解,使其释放更多的DNA；加入适量RNA酶的操作置于细胞裂解后，除去了RNA，同时将引入的蛋白酶除去；)采用改良CTAB法，用适量苯酚、氯仿、异戊醇混合液抽提，除去大量蛋白，提高了杏叶片中DNA的纯度和质量。与常用方法相比，本发明成本低廉。

本发明的进一步的技术方案是：

(1)加入1mL预冷的缓冲浸提液对碾磨好的干燥叶片冰浴15分钟，7000g离心10分钟，弃上清，反复浸提1-2次；该步骤有利于将叶片中的多糖、多酚、酯类等植物次生代谢产物在DNA释放之前将其除去，同时防止它们与DNA形成复合体，促进DNA进一步释放。

(2)在进行液氮碾磨和缓冲浸提液时，分别加入0.001克的PVP-40T，不仅保护了DNA免受氧化,还促进了细胞裂解,释放出更多的DNA。

(3)加入0.01mL 100mg/L RNA酶的操作置于细胞裂解后进行，不仅除去了RNA，同时在能将引入的蛋白酶除去，节省了操作时间。

(4)由于杏植物干燥叶片含有大量的蛋白，仅仅用氯仿异戊醇溶液进行抽提，会残留大量的蛋白使得蛋白难以洗脱和分离，因此我们将CTAB法进行改进，先用苯酚：氯仿：异戊醇(25:24:1，4℃保存)进行抽提，除去了大量的蛋白，提高了杏叶片中DNA的纯度和质量。

更详细的技术方案如《具体实施方式》所述。

本发明具有以下优点：

1.本发明提高了干燥杏植物叶片DNA提取纯度和产出率。

2.使用本发明提取干燥杏叶DNA每份约需试剂费0.6元，是现使用普通试剂盒提取费用的1/9，且提取DNA质量好，产出率高。