[发明专利]一种孔鳐鱼肉蛋白抗氧化多肽及其制备方法和用途

权利要求书

1.一种孔鳐鱼肉蛋白抗氧化多肽，其特征在于该孔鳐鱼肉蛋白抗氧化多肽的氨基酸序列为Asn-Trp-Asp-Met-Glu-Lys-Ile-Trp-Asp，ESI/MS检测分子量为1236.38 Da。

2.一种权利要求1所述的一种孔鳐鱼肉蛋白抗氧化多肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

预处理步骤：孔鳐鱼肉绞碎，按固液比1 g：4~6 mL加入异丙醇，于35~40 ℃脱脂处理1~2 h后，于9 000 r/min离心8~10 min，取沉淀，干燥，得脱脂孔鳐鱼肉；

酶处理步骤：将脱脂孔鳐鱼肉按固液比1 g：4~6 mL加磷酸盐缓冲液，按照脱脂孔鳐鱼肉质量的1.8~2.5%加入中性蛋白酶，于60~70℃温度下酶解3~5 h；

提纯步骤：将酶解液以10 000 r/min于3~5℃下低温离心20~25 min，去除沉淀，取上清液；上清液依次经超滤和层析，得到抗氧化多肽；

酶处理步骤中，所述的中性蛋白酶酶活力≥1.5 AU/g；

酶处理步骤中，所述的磷酸盐缓冲液浓度为0.05 mol/L，pH为 7.0。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述提纯步骤的超滤和层析的具体过程为：

超滤：将上清液用截留分子量1 kDa的超滤膜进行超滤处理，根据对羟基自由基的清除率，收集分子量小于1 kDa部分，得超滤酶解物；

层析：将上述超滤酶解物用双蒸水配成25~30 mg/mL的溶液，经过阴离子交换树脂分离，用双蒸水、0.08~0.12 mol/L、0.45~0.55 mol/L和0.90~1.10 mol/L NaCl溶液进行洗脱，根据280 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，对羟基自由基清除率最高组分为离子交换层析酶解物；将上述离子交换层析酶解物用双蒸水配成20~25 mg/mL的溶液，经过凝胶柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据280 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，对羟基自由基清除率最高组分为凝胶层析酶解物，将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成90~100 μg/mL的溶液，利用反相高效液相色谱进行纯化，根据对羟基自由基的清除率得1个高抗氧化活性多肽Asn-Trp-Asp-Met-Glu-Lys-Ile-Trp-Asp。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述阴离子交换树脂为纤维素DE-52，所述凝胶为葡聚糖凝胶G-15；所述RP-HPLC条件为：进样量20~25 μL；色谱柱为Zorbax SB C-18，4.6 × 250 mm；流动相：30%乙腈；洗脱速度1.0 mL/min；紫外检测波长280 nm。

5.根据权利要求2所述的一种孔鳐鱼肉蛋白抗氧化多肽的制备方法，其特征在于所制备的抗氧化多肽Asn-Trp-Asp-Met-Glu-Lys-Ile-Trp-Asp可有效清除羟基自由基、DPPH自由基和超氧阴离子自由基。

6.权利要求1所述的一种孔鳐鱼肉蛋白多肽用于制备抗氧化药物或保健食品中的用途。