[发明专利]一种孔鳐鱼肉蛋白抗氧化多肽及其制备方法和用途

说明书

技术领域

本发明涉及一种孔鳐鱼肉蛋白抗氧化多肽，本发明还涉及该孔鳐鱼肉蛋白抗氧化多肽的制备方法。

背景技术

孔鳐（Raja porosa）为鳐科鳐属的鱼类，俗称劳板鱼、劳子、甫鱼等，分布于北太平洋西部，中国东海、南海及黄海、渤海均产之。孔鳐肉多刺少，无硬骨，其肉可鲜食，但更多的是腌制加工成淡干鱼。孔鳐鱼干是辽宁、山东等省沿海居民习惯而喜食的水产品。

   目前，申请人研究发现，以孔鳐鱼肉为原料，利用酶解技术制备抗氧化多肽的工艺研究尚处于空白阶段，而以酶解产物为材料制备高活性抗氧化多肽及其应用更是未见报道。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是针对上述的技术现状提供一种孔鳐鱼肉蛋白抗氧化多肽，该多肽可有效清除羟基自由基、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基和超氧阴离子自由基。

本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种孔鳐鱼肉蛋白抗氧化多肽的制备方法。

本发明所要解决的第三个技术问题是提供一种孔鳐鱼肉蛋白抗氧化多肽在用于制备抗氧化药物或保健食品中的用途。

本发明为解决上述第一个技术问题所采取的技术方案为：一种孔鳐鱼肉蛋白抗氧化多肽，其特征在于该多肽的氨基酸序列为Asn-Trp-Asp-Met-Glu-Lys-Ile-Trp-Asp（NWDMEKIWD），ESI/MS检测分子量为1236.38 Da。

本发明为解决上述第二个技术问题所采取的技术方案为：一种孔鳐鱼肉蛋白抗氧化多肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）孔鳐鱼肉绞碎，按固液比1 g：4~6 mL加入异丙醇，于35~40 ℃脱脂处理1~2 h后，于9 000 r/min离心8~10 min，取沉淀，干燥，得脱脂孔鳐鱼肉；

（2）将脱脂孔鳐鱼肉按固液比1 g：4~6 mL加入磷酸盐缓冲液（0.05 mol/L，pH 7.0），按照脱脂孔鳐鱼肉质量的1.8~2.5%加入中性蛋白酶（酶活力≥1.5 AU/g），于60~70℃温度下酶解3~5 h；

（3）将酶解液以10 000 r/min于3~5℃下低温离心20~25 min，去除沉淀，取上清液；上清液依次经超滤和层析，得到抗氧化多肽。

作为改进，所述步骤（3）的超滤和层析的具体过程为：

超滤：将上清液用截留分子量1 kDa的超滤膜进行超滤处理，根据对羟基自由基的清除率，收集分子量小于1 kDa部分，得超滤酶解物；

层析：将上述超滤酶解物用双蒸水配成25~30 mg/mL的溶液，经过阴离子交换树脂分离，用双蒸水、0.08~0.12 mol/L、0.45~0.55 mol/L和0.90~1.10 mol/L NaCl溶液进行洗脱，根据280 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，对羟基自由基清除率最高组分为离子交换层析酶解物；将上述离子交换层析酶解物用双蒸水配成20~25 mg/mL的溶液，经过凝胶柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据280 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，对羟基自由基清除率最高组分为凝胶层析酶解物，将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成90~100 μg/mL的溶液，利用反相高效液相色谱（RP-HPLC）进行纯化，根据对羟基自由基的清除率得1个高抗氧化活性多肽Asn-Trp-Asp-Met-Glu-Lys-Ile-Trp-Asp（NWDMEKIWD）。

优选，所述阴离子交换树脂为纤维素DE-52，所述凝胶为葡聚糖凝胶G-15。

再优选，所述RP-HPLC条件为：进样量20~25 μL；色谱柱为Zorbax SB C-18（4.6 × 250 mm）；流动相：30%乙腈；洗脱速度1.0 mL/min；紫外检测波长280 nm。

本发明为解决上述第三个技术问题所采取的技术方案为：一种孔鳐鱼肉蛋白抗氧化多肽的应用，其特征在于Asn-Trp-Asp-Met-Glu-Lys-Ile-Trp-Asp（NWDMEKIWD）可以有效清除羟基自由基（EC₅₀ 0.176 mg/mL），DPPH自由基（EC₅₀ 0.289 mg/mL）和超氧阴离子自由基（EC₅₀ 0.132 mg/mL），可用于抗氧化方面的药品或保健食品。