[发明专利]一种胎盘干细胞库的构建方法及胎盘组织复苏方法

权利要求书

1.一种胎盘干细胞库构建方法，其特征在于它是按照以下步骤进行：

一、胎盘采集：采集留有3～5cm脐带的完整胎盘，备用；

二、胎盘组织预处理：取步骤一至少3个部位的胎盘组织分别采用组织剪、钳进行仔细剥离、收集，收集后的组织分别用生理盐水洗净血液、剪小至0.5～1mm³大小，分别用生理盐水清洗2～3遍，其中，每次清洗后在1300rpm转速下离心6min，收集沉淀，继续下一次清洗；清洗结束后，收集沉淀备用；

三、组织块冻存液配制：所述冻存液每1mL是由0.68～0.72mL DMEM、0.07～0.12mL胎牛血清、0.01～0.02mL L-谷氨酰胺和0.2mL二甲基亚砜组成，配制好后于4℃预冷保存；或者组织块冻存液采用无血清培养基进行配制；

四、组织程序化冻存：将步骤二预冷保存的组织块用0.5倍组织块体积的培养基重悬配成组织悬液，再加入0.5～1.5倍组织悬液体积的步骤三配制的冻存液，然后分装至冻存管内，首先在程控降温盒中4℃平衡30min，然后转入-80℃过夜暂存；

五、对每一个冻存管设低温防冻条码，进行管理；

六、对步骤二的预处理后的胎盘组织样本和步骤五复苏的胎盘组织进行厌氧菌、需氧菌、霉菌、乙肝病毒、丙肝病毒、艾滋病毒和梅毒检测；将检测结果全部为阴性的胎盘组织转入-150℃～-180℃液氮罐气相中长期保存，即构建出胎盘干细胞库。

2.根据权利要求1所述的一种胎盘干细胞库构建方法，其特征在于所述的胎盘干细胞库包含胎盘绒毛膜间充质干细胞、胎盘羊膜间充质干细胞、胎盘底蜕膜间充质干细胞和胎盘羊膜上皮细胞四种干细胞。

3.根据权利要求1所述的一种胎盘干细胞库构建方法，其特征在于步骤一中采集后的胎盘用无菌生理盐水冲洗表面血液后置于无菌生物样本采样袋内，在4～25℃采集箱内运输，采集箱运输过程要求控制温度恒定，防止颠簸，采集的胎盘需在72小时内进行处理。

4.根据权利要求1所述的一种胎盘干细胞库构建方法，其特征在于所述冻存液每1mL是由0.70mL DMEM、0.10mL胎牛血清、0.15mL L-谷氨酰胺和0.2mL二甲基亚砜组成。

5.根据权利要求1所述的一种胎盘干细胞库构建方法，其特征在于步骤四中的培养基为DMEM、DMEM/F12、AMEM或无血清培养基。

6.根据权利要求1所述的一种胎盘干细胞库构建方法，其特征在于所述的3个部位的胎盘组织包括羊膜、胎盘绒毛膜和胎盘底蜕膜。

7.一种胎盘干细胞库的胎盘组织复苏方法，其特征在于它是按照以下步骤进行的：

一、首先从权利要求1构建的胎盘干细胞库中取出冻存管放在37℃～40℃水浴中1～2min进行解冻；

二、将步骤一解冻后的胎盘组织放入洁净的离心管中，加入2～3倍体积的DMEM混匀，然后在4℃温度、转速为1300转/分钟的条件下离心6min，去上清收集固相物，重复离心操作2～3次，收集固相物；

三、将步骤二收集的固相物接种到T75培养瓶中，加入DMEM培养液后置于CO₂培养箱内培养2天后，计算贴壁组织块数量和悬浮组织块数量；

通过如下方式计算组织块贴壁成活率：

贴壁成活率＝培养瓶中贴壁成活的组织块数量/(培养瓶中贴壁成活的组织块数量+培养瓶中悬浮未贴壁组织块数量)*100％；

即完成胎盘干细胞库的胎盘组织复苏。

8.一种胎盘干细胞库的胎盘组织复苏方法，其特征在于它是按照以下步骤进行的：

一、首先从权利要求1构建的胎盘干细胞库中取出冻存管放在37℃～40℃水浴中1～2min进行解冻；

二、将步骤一解冻后的胎盘组织放入洁净的离心管中，加入2～3倍体积的DMEM混匀，然后在4℃温度、转速为1300转/分钟的条件下离心6min，去上清收集固相物，重复离心操作2～3次，收集固相物；

三、对步骤二收集的固相物进行酶解30～50min后，在4℃温度、转速为1300转/分钟的条件下离心6min，去上清收集沉淀的细胞，经DMEM悬浮后取样测定细胞活率并通过如下方式计算复苏细胞活率：细胞活率＝活细胞数量/(活细胞数量+死细胞数量)*100％；并计算复苏后的细胞总数数量；即完成胎盘干细胞库的胎盘组织复苏。