[发明专利]一种胎盘干细胞库的构建方法及胎盘组织复苏方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种胎盘干细胞库的构建方法及胎盘组织复苏方法。

背景技术

胎盘是宝宝赖以生存的各种营养物质输送的纽带，由羊膜、绒毛膜和底蜕膜构成。羊膜和绒毛膜来源于胎儿，底蜕膜则起源于母体。胎盘除在胎儿发育、营养支持和维持耐受中发挥重要作用外，还是一个机体的干细胞储备库。

胎盘中有多种多能干细胞，目前已知的至少有三类胎盘干细胞。胎盘中第一类多能干细胞为间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)，MSCs是一类能够自我更新，具有多向分化能力的多能干细胞，可以分化为骨、软骨、脂肪、神经和肝细胞等组织细胞。

胎盘MSCs能抑制免疫和促进造血重建的特性，使其在造血干细胞移植及移植后GVHD防治方面具有良好的应用前景。由于胎盘来源MSCs与骨髓来源MSCs相比具有组织来源广和细胞增殖能力强的优势，使其具有更好的临床应用前景。胎盘MSCs至少可以分为3种，绒毛膜MSCs、羊膜MSCs，还包括来自母体的底蜕膜组织的MSCs，通过对绒毛层和底蜕膜MSCs的免疫标记检测，发现它们均表达典型的MSCs表面抗原CD13、CD29、CD44、CD54、CD73、CD105，不表达造血干细胞表面抗原CD3、CD14、CD34、CD45和内皮细胞表面抗原CD31。通过检测发现，绒毛膜MSCs还弱表达胚胎干细胞类表面抗原SSEA-4，而羊膜MSCs表达典型的MSCs表面抗原外，还表达胚胎干细胞类的表面标志物Oct-4。而底蜕膜作为母-胎界面的组成部分之一，为母体面，意味着来源于底蜕膜的MSCs可作为母亲来源的干细胞的一种。

胎盘中的第二类多能干细胞为羊膜上皮细胞(human amniotic epithelial cells,hAECs)。人hAECs作为一种干细胞，表达多种胚胎干细胞类标志物，包括SSEA-4、SSEA-3、TRA-1-60、TRA-1-80，hAECs表达多潜能干细胞特定的转录因子OCT-4和Nanog基因。同时具有向心肌、肝、神经细胞以及胰岛细胞等多系分化的潜力，因此人hAECs是介于胚胎干细胞和成体干细胞之间的一个中间等级的干细胞。研究中表明，hAECs不表达HLA-A、B、C、DR等人类白细胞抗原具有免疫赦免性，移植后可以避免免疫排斥反应的发生，具有非常广泛的临床应用前景，近年来收集和保存羊膜上皮细胞也成为未来进行临床应用创造了条件。

胎盘中的第三类干细胞为胎盘造血干细胞(human placenta-derived hemopoietic stem cells,hPD-HSCs)。hPD-HSCs是通过剪切胎盘胎儿面组织成0.5mm3的组织块，经中性蛋白酶、胰蛋白酶及胶原酶等进行组织消化，或者经CXCR-4受体阻滞剂AMD3100加入灌注液灌注法获得中间层单个核细胞。其CD34、CD133等造血干细胞表明抗原表达均为阳性。与流动的脐带血相比，胎盘组织间隙中的hPD-HSCs中CD34阳性细胞是脐带血中的数倍，胎盘CD34+CD38+hPD-HSCs亚群细胞分化形成的粒细胞单核细胞集落、爆红型集落、混合型集落数均明显高于脐带血造血干细胞。hPD-HSCs的临床应用价值类似于脐带血造血干细胞，可以在治疗血液疾病，如急慢性白血病、再生障碍性贫血、地中海贫血和淋巴瘤等方面有较好的效果，是一个可以补充脐带血造血干细胞数量不足的重要干细胞资源。

目前，国内外针对胎盘干细胞储存方式为单一部位取样，然后体外培养扩增，达到一定数量后进行深低温冻存。这种方式只进行了胎盘组织中一种干细胞的扩增、培养，而大部分干细胞没有能够得到保存。本发明提供了一种胎盘干细胞库构建方法，本方法保存了至少3个胎盘组织部位(包括但不限于羊膜、绒毛膜、胎盘底蜕膜)，也保存了目前已知的多种干细胞，同时，对胎盘组织中目前未知的、将来可能发展应用潜力更大的干细胞也进行了保存，此方法简化操作步骤、提高效率、且保存了多种干细胞资源，为未来定制化干细胞分离、培养、扩增奠定了基础。

发明内容

本发明是为胎盘组织的不同部位保存提供可靠的方法，此方法用于胎盘干细胞库建立，分离不同功能的干细胞，延长胎盘组织的保存时间，保证组织内细胞不受影响，保证组织细胞的活性，操作方法简单，复苏后可直接用于干细胞分离培养。