[发明专利]一种人羧酸酯酶hCE2的高特异性荧光探针及其应用

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及人羧酸酯酶亚型2(hES2)的特异性荧光探针及其应用。

背景技术

羧酸酯酶(Carboxylesterase，CES)是机体内重要的Ⅰ相水解代谢酶，催化多种内源性和外源性化合物发生酯键断裂，释放出极性的醇和羧酸分子片段，后者进而被体内CYP450或UGTs等其他代谢酶继续催化代谢，使药物分子更有效地被排出体外。多种结构中含有酯键的药物分子，如盐酸伊立替康(irinotecan，CPT-11)、奥司他韦(达菲)、氯吡格雷等均被羧酸酯酶催化进行活化或代谢消除。

人体内介导药物代谢的羧酸酯酶主要分布在2个家族：hCE1和hCE2，其中hCE1又可继续被分为hCE1b和hCE1c两种亚型。hCE1和hCE2具有不同的组织分布特异性及底物选择性，人的肝脏中主要分布表达hCE1，同时表达一定量的hCE2，而小肠中则基本以hCE2亚型为主，只有极少量的hCE1分布。近年来发现多种肿瘤细胞中hCE2的表达水平上调，可借助此特征设计经hCE2特异性水解的抗肿瘤前体药物实现靶向选择性杀伤肿瘤细胞的目的。此外，多数口服前药需先经过肠道才能被吸收进入血液循环，因此肠道中hCE2酶对酯类药物的代谢被认为是其首次代谢的重要组成部分，hCE2酶活性的差异对于前体药物的生物利用度具有十分重要的影响。此外，有些经静脉给药的前体药物，如盐酸伊立替康，会经过胆汁排泄被分泌到肠道中，继而被肠道中的hCE2催化水解释放出毒性代谢产物SN-38，后者被认为是导致伊立替康迟发型腹泻副作用的主要原因。因而，建立基于探针的高通量技术手段，对于筛选hCE2的高效抑制剂并将其应用于减缓伊立替康导致的迟发型腹泻，以及对hCE2功能的定量检测都十分重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人羧酸酯酶hCE2的特异性荧光探针及其应用，该底物原型和水解产物的荧光属性具有明显差异，且产物更易检测。利用该探针反应可对多种生物体系中hCE2的分布和功能进行定量评价。

本发明提供了一种人羧酸酯酶亚型2(hCE2)的特异性荧光探针底物，该底物的酯键在人源组织或细胞中可被hCE2特异性水解为相应水解产物并显示与底物不同的发射波谱；该底物是以4-三氟甲基-7-羟基香豆素类化合物为原料，通过酯化反应获得相应7-羟基酯类衍生物，其结构通式如式(1)所示，其中，R为苯基、对甲基苯基、对乙基苯基、对丙基苯基、对己基苯基、对硝基苯基、对氯苯基、1-奈基、2-呋喃基、2-噻吩基、(4-苯基)苯基、4-乙氧基苯基取代基中的一种。

如当R为氢时，该底物为4-三氟甲基-7-苯甲酰氧基香豆素。

本发明还提供了hCE2的特异性荧光探针底物的应用，该底物作为hCE2的特异性底物，发生水解反应，通过定量检测单位时间内水解产物的生成量来测定酶或细胞制备液等生物样品及细胞中hCE2的活性；具体测定方法为：

——体系中以4-三氟甲基-7-羟基香豆素类化合物7-羟基的酯类衍生物作为特异性探针底物；底物浓度选择1/10～10K_m；单点测定时底物浓度优选K_m。

——在PBS或Tris-HCl等常用缓冲液中，反应温度为20℃至60℃之间，优选37℃为最优反应时间；孵育体系pH介于5.5～10.5之间，优选pH 7.4为最优反应pH值；

——反应时间为5～120分钟，在确保以上底物相应的水解产物达到定量限且底物转化率不超过20％时终止反应；

——测定单位时间内水解产物生成量作为羧酸酯酶hCE2活性的评价指标。

本发明提供的人羧酸酯酶2特异性荧光探针底物的应用，所述底物消除率或水解产物的生成率应介于0.1％～20％之间。

本发明提供的人羧酸酯酶2特异性荧光探针底物的应用，探针底物及其水解产物均具有荧光属性，可采用荧光检测器实现产物及底物的快速灵敏检测；荧光检测条件为：激发波长380nm，在420～660nm进行荧光发射谱的检测。此外，该特异性探针底物及相应hCE2活性检测过程不会受生物体系基质及杂质的干扰，可用于各种生物体系中hCE2酶活性的定量测定。

该特异性探针反应可用于重组羧酸酯酶、人及动物组织制备液及各类组织细胞中hCE2酶活性的定量测定，还可用于快速筛选hCE2酶的抑制剂及抑制能力的定量评价。