[发明专利]用于检测鲍曼不动杆菌的LAMP试剂盒及其专用引物

权利要求书

1.用于检测鲍曼不动杆菌的LAMP引物，是根据鲍曼不动杆菌β-内酰胺酶OXA-51基因(bla_OXA-51)的特异性保守序列设计的，用以定性检测纯菌、患者痰液、血液及其它分泌物等样品中的鲍曼不动杆菌，所述LAMP引物由五条引物组成，包括外引物F3和B3、内引物FIP和BIP、以及环引物LF的组合；所述鲍曼不动杆菌β-内酰胺酶OXA-51基因(bla_OXA-51)的特异性保守序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的LAMP引物，其特征在于：所述用于对鲍曼不动杆菌进行LAMP检测的五条引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2(F3)、SEQ ID NO：3(B3)、SEQ ID NO：4(FIP)、SEQ ID NO：5(BIP)和SEQ ID NO：6(LF)所示。

3.根据权利要求2所述的LAMP引物，其特征在于：所述的LAMP引物，为F3和B3、FIP和BIP、以及LF按摩尔比5:40:20的组合物。

4.一种用于对鲍曼不动杆菌进行LAMP检测的试剂盒，包括权利要求1或2或3所述用于对鲍曼不动杆菌进行LAMP检测的引物。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括以下用于25μl反应体系的试剂：20mM Tris·HCl(pH8.8)，10mM KCl，10mM(NH₄)₂SO₄，0.1％Tween20，0.8M甜菜碱(betaine)，8mM MgSO₄，1.4mM dNTP each，8U Bst DNA polymerase，引物加入量为：5pmol引物F3和B3，40pmol引物FIP和BIP，20pmol引物LF。

6.根据权利要求5所述的LAMP引物，其特征在于：所述试剂盒中还可包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为鲍曼不动杆菌标准株基因组DNA，所述阴性对照为不含DNA的LAMP扩增体系，如双蒸水。

7.权利要求1或2或3所述的LAMP引物或权利要求4或5或6所述的试剂盒在鲍曼不动杆菌的LAMP检测中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：一种鲍曼不动杆菌的LAMP检测方法，包括以下步骤：

1)以待测样品基因组DNA为模板，在权利要求1或2或3所述引物的引导下进行LAMP扩增，25μl LAMP反应体系包括：待测样品基因组DNA2μl，20mM Tris·HCl(pH8.8)，10mM KCl，10mM(NH₄)₂SO₄，0.1％Tween20，0.8M甜菜碱(betaine)，8mM MgSO₄，1.4mM dNTP each，8U Bst DNA polymerase，引物加入量为：5pmol引物F3和B3，40pmol引物FIP和BIP，20pmol引物LF；LAMP扩增条件为：置60-65℃恒温40-50min；

2)反应结束后进行结果判定：在反应液中添加钙黄绿素指示剂，根据反应液的颜色变化判断结果，绿色表示待测样品中存在鲍曼不动杆菌，橙色表示待测样品中不存在鲍曼不动杆菌；或者不添加钙黄绿素指示剂直接用浊度仪检测反应前后反应液的浊度变化来判断结果，浊度上升表示待测样品中存在鲍曼不动杆菌，浊度无变化表示待测样品中不存在鲍曼不动杆菌。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述步骤1)中的LAMP反应体系中还设有阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为鲍曼不动杆菌标准株基因组DNA，所述阴性对照为不含DNA的LAMP扩增体系，如双蒸水；所述LAMP扩增条件优选为：置65℃恒温50min。

10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于：所述步骤2)中钙黄绿素指示剂的添加量可为1μl(终反应体系为26μl)，含有0.5mM钙黄绿素和10mM氯化锰。