[发明专利]液固相结合合成富勒烯双加成多肽的方法

说明书

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及一种液固相结合合成的富勒烯双加成多肽的制备方法，该化合物大大的提高了富勒烯在极性溶液中的溶解度，提高了生物学利用度及其对细胞的靶向性问题。

背景技术

富勒烯C₆₀因具有特殊的物理、化学性质显示了较独特的生物学活性，可归纳为光敏性作用与非光敏性作用。前者与富勒烯球笼受光诱导在氧存在时产生单线态氧等自由基有关，包括光激发的DNA断裂、细胞膜损伤和细胞毒性等。不断增加的研究资料显示富勒烯衍生物在生物医药领域具有相当广泛的应用前景，如作为光动力学治疗中的光敏剂、抗衰老药物、反义核酸药物和药物载体，其光敏作用的研究与应用逐渐成为富勒烯研究的前沿和热门方向。越来越多的研究表明富勒烯量子产额高，比目前临床应用的光敏剂效果好得多，且对正常皮肤、小鼠体重及血液中一些酶含量基本上没有影响，为富勒烯作为肿瘤动力学治疗中的光敏剂提供了理论依据；但也有不同的研究结论，还需要进一步深入系统地研究来证实。

    不同的多肽具有不同的生物功能和用途，常用的功能肽有RGD肽、PHLATLF肽和TISWPPR肽等，短肽PHLATLF对卵巢癌A2780细胞具有生长抑制作用，TISWPPR这个七肽(TR-7)对大肠癌有特异性亲和作用，主要是对肿瘤干细胞的特异性标记分子CD133有特异性的高亲和作用，对肿瘤细胞的增殖能力及粘附能力没有显著影响，对肿瘤细胞的迁移运动能力有显著的抑制作用。其中RGD肽是一类含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp）3个氨基酸的小分子多肽，可以与在某些肿瘤细胞高表达的整合素α_Vβ₃分子发生特异性结合，α_Vβ₃在正常组织系统极少表达甚至不表达，也使其成为肿瘤靶向治疗理想的靶点。配体RGD与α_Vβ₃受体结合的特异性强，亲和力高，是有效的药物载体。

基于以上系列研究基础，我们拟设计合成一种新型的富勒烯衍生物的纳米光敏剂。为富勒烯修饰的RGD肽：FBP（RGD），这样一方面可以增加肽的稳定性及富勒烯的水溶性，充分发挥RGD肽的生物活性，从而获得肿瘤靶向的光敏剂；另一方面，建立的实验方法还可以用来连接不同的多肽（如抗体或表面受体），随着功能肽的变换而获得不同的生物学活性。富勒烯光动力学研究有不少报道，但合成的化合物结构复杂，很少有在生物学方面进一步系统的研究，对于这种富勒烯衍生物的纳米颗粒的光敏性等抗肿瘤活性研究更是未见报道。

发明内容

本发明的目的是体供一种液固相结合合成富勒烯双加成多肽的方法，大大提高了富勒烯在极性溶液中的溶解度，且具有良好的抗癌活性和清除自由基的能力。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种富勒烯双加成多肽，结构式如下：

其中P为RGD肽、TISWPPR 肽或PHLATLF 肽。

一种富勒烯双加成多肽的制备方法，包括以下步骤：

（1）N-取代富勒烯双加成吡咯烷（制备方法见专利201410114391.X）与只有一个活性羧基的酸性氨基酸在二环己基碳二亚胺（DCC）、1-羟基苯并三唑（HOBT）、4-二甲氨基吡啶（DMAP）的存在下，在氮气保护下，用液相合成法进行缩合反应，室温避光搅拌反应24~72小时，反应结束后，硅胶柱层析分离纯化得到氨基和羧基均被保护的富勒烯双加成氨基酸；

（2）氨基和羧基均被保护的富勒烯双加成氨基酸加入三氟乙酸（TFA）/二氯甲烷（DCM）的混合溶液中，室温搅拌反应0.5~12h，经脱保脱除羧基保护基得到仅含氨基保护基的富勒烯双加成氨基酸；

（3）将仅含氨基保护基的富勒烯双加成氨基酸溶于N,N二甲基甲酰胺（DMF）/DCM混合溶剂中，然后加入树脂-多肽（仅有一个活性氨基，并且在端位）、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐（HBTU）、1-羟基苯并三唑（HOBT）和N,N-二异丙基乙胺（DIEA），在室温下用固相合成法进行缩合反应，产物经脱保、裂解得到富勒烯双加成多肽；

以上各个步骤均在无水无氧的条件下进行；

所述步骤（1）中的只有一个活性羧基的酸性氨基酸为天冬氨酸或谷氨酸；

所述步骤（3）中的树脂-多肽为树脂-RGD肽、树脂-TISWPPR 肽或树脂-PHLATLF 肽。