[发明专利]抗EGFR单克隆抗体生物学活性检测方法

权利要求书

1.一种抗EGFR单克隆抗体生物学活性检测方法，其步骤如下：

1)A431细胞复苏、传代；

2)准备96孔板单层A431细胞；

3)样品和rhEGF的稀释：样品先稀释到0.12mg/ml，再以2倍梯度稀释7个浓度梯度，稀释rhEGF到100ng/ml；

4)将样品的7个稀释梯度加入到铺有A431细胞的96孔板，每孔50μl；按每孔50μl体积加入浓度为100ng/ml的rhEGF；细胞经以上处理后，放入37℃、5％CO₂培养60分钟；

5)弃去96孔板中的细胞培养液，每孔加入100μl 4％甲醛固定15min；每孔100μl TBS洗板2次；每孔加入100μl 0.1％TritonX-100，孵育15min；每孔100μl TBS洗板1次；每孔加入100μl 1％H₂O₂，孵育15min；每孔100μl TBS洗板1次；每孔加入100μl 2×Blocking buffer，孵育60min；

6)弃去2×Blocking buffer，每孔加入100μl一抗稀释液；96孔板放入2-8℃孵育过夜；弃去一抗稀释液，每孔100μl TBST洗板4次；每孔加入100μl二抗稀释液，避光孵育60min；弃去二抗稀释液，每孔200μl TBST洗板3次；

7)每孔加入100μl TMB显色底物，避光孵育10-25min，或孵育至显蓝色到预期深浅；每孔加入100μl 2mol/L H₂SO₄，终止显色；

8)96孔板放入读板机，检测A450nm和A650nm下读数。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中，复苏一管A431细胞，900rpm离心5分钟，移除上清，加10ml生长培养基重悬移至T175培养瓶，补加20ml生长培养基，放入37℃、5％CO₂培养。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中，A431细胞的传代操作为：培养3天后，移除培养瓶中的细胞，加5ml 0.25％胰酶-EDTA，轻轻晃动使液体浸没细胞，倒掉胰酶，将细胞放入37℃培养箱消化5分钟，加入20ml生长培养基终止消化，重悬后取细胞计数，按1:3比例对细胞进行传代。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中，用维持培养基稀释细胞密度到2×10⁵cells/ml，将A431细胞铺板在96孔板，每孔150μl，37℃、5％CO₂培养24小时。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的生长培养基为RPMI1640添加10％FBS。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的维持培养基为RPMI1640添加0.5％FBS。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的一抗稀释液为abcam32430，稀释1000倍。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的二抗稀释液为abcam6721，稀释20000倍。