[发明专利]抗EGFR单克隆抗体生物学活性检测方法

说明书

技术领域

本发明属于细胞工程领域，具体涉及一种抗EGFR单克隆抗体生物学活性检测方法。

背景技术

EGFR(表皮生长因子受体)是一种糖蛋白，属于酪氨酸激酶型受体，细胞膜贯通，分子量170KDa。EGFR位于细胞膜表面，靠与配体结合来激活，包括EGF和TGFα。激活后，EGFR由单体转化为二聚体，EGFR二聚后可以激活它位于细胞内的激酶通路，包括Y992、Y1045、Y1068、Y1148和Y1173等激活位点。这个自磷酸化可以引导下游的磷酸化，包括MPAK，Akt和JNK通路，诱导细胞增殖。抗EGFR单克隆抗体能竞争性与EGF结合EGFR，抑制EGF的信号转导。

基因工程药物的生物学活性与药效学基本一致，对其进行生物学活性检测，定量其效价单位，是基因工程药物产品质量控制的重要组成部分，是保证产品药效的重要手段。对生物学活性的定量越准确，对产品药效的控制就越有保障。生产出来的单抗产品的生物学活性是蛋白质药物的重要质控指标，直接反映药品生物学效能的大小。根据产品的性质、药效学特点，活性测定可分为生化酶促及免疫学方法、体内测定法、体外细胞培养测定法。

生化酶促及免疫学方法(如ELISA)是一种不依赖活体系统的检测方法，被广泛采用。ELISA实验中，抗原结合到固相载体表面，待检测抗体与抗原结合。二抗与某种酶连接成酶标抗体，这种酶标抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，二抗加入到检测体系中，与待测目标抗体结合，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与样品中受检抗体的量直接相关，根据颜色反应的深浅定性或定量分析。

体内测定法就是利用动物体内某些指标的变化，定出产品的单位。体内测定法能为较大范围的重组产品的效价提供有用信息，但检测过程通常相对不精确，并且费时、昂贵、难操作。为获得可信的效价值，通常需要使用相当数量的动物。

体外细胞培养测定法，就是利用产品对受试细胞的促进(或抑制)作用，通过检测最终活细胞数量来定量产品的活性单位。

抗EGFR单克隆抗体的生物学效能是通过与EGFR结合，将信号转导到受体的激酶，其抗原决定簇与生物学活性部位不一致，不能通过其抗原决定簇与受体的结合直接反应生物学活性的大小。而体外细胞培养法，误差置信范围大，精确度不高。在体外细胞抑制过程中，会出现细胞被待检抗体抑制而未凋亡，检测结果使活性检测准确度欠佳。

发明内容

本发明的目的是针对以上要解决的技术问题，提供一种精确、有效的抗EGFR单克隆抗体生物学活性检测方法。

本发明提供了一种抗EGFR单克隆抗体生物学活性检测方法，其步骤如下：

1)A431细胞复苏、传代；

2)准备96孔板单层A431细胞；

3)样品和rhEGF的稀释：样品先稀释到0.12mg/ml，再以2倍梯度稀释7个浓度梯度，稀释rhEGF到100ng/ml；

4)将样品的7个稀释梯度加入到铺有A431细胞的96孔板，每孔50μl；按每孔50μl体积加入浓度为100ng/ml的rhEGF；细胞经以上处理后，放入37℃、5％CO₂培养60分钟；

5)弃去96孔板中的细胞培养液，每孔加入100μl 4％甲醛固定15min；每孔100μl TBS洗板2次；每孔加入100μl 0.1％TritonX-100，孵育15min；每孔100μl TBS洗板1次；每孔加入100μl 1％H₂O₂，孵育15min；每孔100μl TBS洗板1次；每孔加入100μl 2×Blocking buffer，孵育60min；

6)弃去2×Blocking buffer，每孔加入100μl一抗稀释液；96孔板放入2-8℃孵育过夜；弃去一抗稀释液，每孔100μl TBST洗板4次；每孔加入100μl二抗稀释液，避光孵育60min；弃去二抗稀释液，每孔200μl TBST洗板3次；

7)每孔加入100μl TMB(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺)显色底物，避光孵育10-25min，或孵育至显蓝色到预期深浅；每孔加入100μl 2mol/L H₂SO₄，终止显色；

8)96孔板放入读板机，检测A450nm和A650nm下读数。