[发明专利]一种鲫鱼疱疹病毒病JDORF25疫苗及制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种鲫鱼疱疹病毒病疫苗(JDORF25)及制备方法和应用。

背景技术

鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus Ⅱ,CyHV-2)感染异育银鲫是近年新出现的一种严重病毒性疾病，已经造成重大经济损失。鲤疱疹病毒Ⅱ型最早在观赏金鱼中发现，称为“金鱼疱疹病毒性造血器官坏死症”。该病毒因其是第二个分离自鲤科鱼的疱疹病毒，国际病毒系统分类与命名委员会将其命名为鲤疱疹病毒II型(CyHV-2)。CyHV-2与鲤痘疮病毒(Car p pox herpesvirus,Cyprinid herpesvirus Ⅰ,CyHV-1)及锦鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus,Cyp rinid herpesvirus3,CyHV-3)的关系接近，属于鲤疱疹病毒科成员，目前CyHV-2的全基因组测序与注释研究已经完成，对CyHV-2重要功能基因的研究正陆续展开，但对病毒疫苗制备方面研究相对较少。CyHV-2 ORF25是一个重要的免疫相关基因，存在一个跨膜结构域，是制备预防鲫鱼疱疹病毒病疫苗的重要靶基因。本发明通过对鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF25基因编码蛋白进行分析，选择亲水性和抗原性强的区域表达制备疫苗。

巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)是一种新型真核表达系统，能稳定高效表达外源蛋白，并能对表达产物进行翻译后加工和修饰，同时，其成熟的高密度发酵技术为目的蛋白的工业化生产提供了保障。自1984年应用毕赤酵母表达外源蛋白以来，已有400多种蛋白在该系统中成功表达，部分成果已进入商品化生产。

由于遗传密码具有简并性，一种氨基酸可以有1-6个使用频率不同的同义密码子。对于特定的物种，高表达的基因往往使用部分特定的同义密码子，这些密码子被认为是该物种高表达基因的优越密码子，这种现象称为密码子偏爱性。密码子的偏爱性使得克隆的外源基因往往难以在异种生物细胞高效表达。在酵母中获得高效表达的外源基因往往都是酵母偏爱密码子所编码的基因，通过对酵母基因使用密码子的统计分析证实所有的61个密码子中有25个是酵母所偏爱的，因此对密码子进行偏爱性改造能大量提高重组蛋白在该系统中的表达量。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种鲫鱼疱疹病毒病疫苗，该疫苗为将鲤疱疹病毒Ⅱ型免疫相关ORF25基因截短优化后翻译的重组蛋白JDORF25，其序列为SEQ ID NO.2所示，对应的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

本发明的另一个目的在于提供了一种鲫鱼疱疹病毒病疫苗的制备方法，申请人提供了一株巴斯德毕赤酵母Km71/CyHV-2-25 Pichia pastoris Km71/CyHV-2-25菌株，该菌株包含有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，将该菌株发酵可制备鲫鱼疱疹病毒病疫苗。该菌株已于2014年11月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号：CCTCC NO：M2014570，分类命名：巴斯德毕赤酵母Km71/CyHV-2-25 Pichia pastoris Km71/CyHV-2-25，地址：中国武汉 武汉大学。

本发明的最后一个目的在于提供了一种鲫鱼疱疹病毒病疫苗在制备鲤疱疹病毒Ⅱ型疫苗中的应用。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

一种鲫鱼疱疹病毒病疫苗的获得：

分析Genbank公布的鲤疱疹病毒Ⅱ型免疫相关ORF25基因(JQ815364.1)，找到亲水性和抗原性强的区域，按酵母密码子偏好性进行优化，合成该基因片段，其序列为SEQ ID NO.1所示，根据优化片段的基因序列设计引物(JDORF25 1F和JDORF25 1R)进行PC R反应，克隆获得截短优化的ORF25基因，转入酵母表达载体，获得重组表达载体，然后再将其导入酵母表达菌种，筛选高拷贝克隆，获得重组毕赤酵母表达菌，该菌株已于2014年11月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号：CCTCC NO：M2014570，分类命名：巴斯德毕赤酵母Km71/CyHV-2-25 Pichia pastoris Km71/CyHV-2-25，地址：中国武汉武汉大学。