[发明专利]一种检测水体重金属镉的微生物学方法

说明书

本发明涉及一种检测重金属镉的微生物学方法，具体涉及一种检测镉大肠杆菌工程菌株的构建方法及其检测水中镉方法的建立。本发明所述工程菌株的构建，首先采用Red重组系统敲除大肠埃希氏菌镉抗性zntA和zntR基因，然后采用基因敲入技术将pmerR‑MerR(M)‑pmerR‑gfpmut2报告基因置换到zntR编码基因位置后获得。本发明所述工程菌株对镉的最低检测范围符合《污水综合排放标准》‑‑‑GB8978‑1996，克服了基于质粒载体的工程菌株具有荧光本底值高、检测信号差等缺陷。本发明所述工程菌株可与AAS等理化分析法互补分析镉的生物有效性及其总量，为客观评价镉的生物毒性大小提供依据。

技术领域

本发明涉及一种检测水体重金属镉的微生物学方法，具体涉及利用基因工程技术改造的大肠埃希氏菌的构建方法，及建立其在检测水体环境中重金属镉的方法。

背景技术

重金属镉(Cadmium，Cd)是被国际癌症研究署(IARC)归类为第一类的人类致癌物；美国国家毒理学计划(NTP)也把镉确认为人类致癌物。水体重金属镉污染已经在我国局部地区表现为公害病，如广东镉大米事件、广西龙江镉污染事件等，引起了人们的高度重视。镉在环境中非常稳定，不易被生物降解，在水体和土壤中的含量逐年增加，继而在一些植物或动物体内积累，如镉污染区的大米、贝壳类海鲜、动物肝肾脏等，并通过食物链在人体内蓄积，为目前已知的最易在体内蓄积的毒物之一。镉对人体毒性很大，对肾、肺、肝、睾丸、脑、骨骼及血液系统均可产生毒性，主要积蓄在肾脏，引起泌尿系统的功能变化，一旦进入人体将很难排除。镉能够干扰骨中钙，如果长期摄入微量镉，使骨骼严重软化，骨头寸断，引起骨痛病，其还会引起胃脏功能失调，并干扰人体和生物体内锌的酶系统，导致高血压症上升。随着工业的迅速发展，镉及其化合物被广泛应用于电镀等行业。镉对环境的污染，主要是由工业废水排放引起(我国《污水综合排放标准》---GB8978-1996规定工业废水中镉的最高排放浓度为0.1mg·L^-1)。因此，对环境水体中重金属镉的检测显得尤为必要。

目前监测和检测重金属污染物主要有两种方法：(1)物理化学分析法，如电感耦合等离子体原子发射光谱(ICP-AES)、电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)等，其优点是具备高检测灵敏度和高特异性，但也存在一些不足，如仪器设备昂贵，操作复杂，检测周期长，最重要的一点是，传统的物理化学方法主要是对环境重金属总量进行测定，不能检测重金属的生物可利用度；(2)基于生物有机体的微生物法，其一般分为基于质粒和基于基因组整合型两种。质粒整合型具有成本低、特异性强、快速、易操作等优点，但是基于质粒载体的工程菌株存在细菌传代后质粒拷贝数不均一，数量过高或丢失而导致检测信号不稳定、荧光本底值高和独立实验重复性不好等缺陷。

生物检测技术的基本原理即是利用模式生物对特定化学物质的分子反应机理。对于生物检测技术而言需要三种必需的元件：针对特定或具有相似性质的化学物质的感应器；由感应器控制的启动子；受此启动子控制的报告基因。在设计生物检测技术时，由于细菌具有在环境中大量存在、生长快速、低成本及易维护等优点而受到研究人员普遍亲睐。在过去的研究中利用生物检测法来检测环境中的特定污染物已经引起了极大的关注，至今已经研发了一系列针对特定有机物和无机化合物的工程菌株及其产品，如：重金属、甲苯及其衍生物等。