[发明专利]一种快速建库方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程及分子生物学领域，更具体地说，涉及一种快速建库方法、SNP分型方法和测序方法。

背景技术

在现阶段，通过测序技术对目标区域的序列进行测定，往往需要构建文库分子，构建文库分子的方法一般包括以下步骤：一）通过PCR扩增获得含待测定目标区域的核酸分子；二）在含待测定目标区域的核酸分子的两端分别连接不同的接头分子，获得测序文库。但是，在步骤二）中，为了实现这两种接头分子与含待测定目标区域的核酸分子的定向连接，需要依次进行切割、连接，或连接、切割、连接的反应，且为了保证获得文库分子的纯度，减少非目标产物（两种接头自身或相互之间连接的产物、接头连接位置错误的产物）的生成，在上述2步或3步反应中需要进行1至2次的分离纯化步骤，建库步骤繁杂，效率低。

在上述方法基础上进行的SNP分型方法和测序方法，均存在步骤繁杂，建库效率低的问题。

因此，需要一种新的快速建库方法、SNP分型方法和测序方法，简化实验步骤，提高建库效率。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速建库方法、SNP分型方法和测序方法，旨在解决现有技术中步骤繁杂，建库效率低的问题。

为了实现发明目的，发明人提供了一种快速建库方法，包括以下步骤：

A、PCR扩增待测序样本，得扩增产物；所述PCR扩增过程中用于PCR扩增的PCR引物对中至少有一种PCR引物上含有可断裂位点或可切除序列；

B、将扩增产物加至切割-连接反应体系中进行切割和连接，得含接头一的文库分子；所述切割-连接反应体系包括：连接酶、断裂剂、接头一和连接缓冲液；

所述断裂剂，用于对扩增产物中的可断裂位点或可切除序列进行特异性切割，形成第一粘性末端；

所述接头一为核酸分子，含有与第一粘性末端完全互补配对的第二粘性末端。

其中，所述可断裂位点或可切除序列为核糖核苷酸、RNA序列或限制性内切酶识别序列。

其中，所述断裂剂为USER酶、RNase H或限制性内切酶。

其中，所述切割-连接反应体系还包括接头二，所述接头二用于与第一粘性末端所在末端的相对端连接。

其中，步骤A中PCR扩增使用的聚合酶为pfu酶或Taq酶，进一步的，所述聚合酶为Taq酶。

其中，所述接头二的一端为单碱基突出末端；所述单碱基突出末端为T，其位于所在链的3’端。

其中，所述接头一为双链核酸分子，其第二粘性末端所在链的5’末端含生物素标记。

进一步的，所述接头一被预先固定在磁珠上。

其中，PCR引物上的所述可断裂位点或可切除序列的3’端与其所在链5’末端的距离为1至8个碱基。

其中，步骤A中用于扩增的PCR引物对的两种引物上均含有可断裂位点或可切除序列，且同一对PCR引物对中的可断裂位点或可切除序列所形成的第一粘性末端之间不能互补配对。本方案中，接头一和接头二在步骤B分别与扩增产物两端被切割形成的不同的第一粘性末端连接。

为了更好地实现发明目的，本发明还提供了一种基于上述任一种快速建库方法的SNP分型方法，包括以下步骤：

A、PCR扩增待测序样本，得含待测SNP位点的扩增产物；所述PCR扩增过程中用于PCR扩增的PCR引物对中至少有一种PCR引物上含有可断裂位点或可切除序列；

B、将含待测SNP位点的扩增产物加至切割-连接反应体系中进行切割和连接，得含接头一的文库分子；所述切割-连接反应体系包括：连接酶、断裂剂、接头一和连接缓冲液；所述断裂剂，用于对扩增产物中的可断裂位点或可切除序列进行特异性切割，形成第一粘性末端；所述接头一为核酸分子，含有与第一粘性末端完全互补配对的第二粘性末端；

C、将含接头一的文库分子可寻址的固定在固相载体上；

D、对固定在固相载体上的文库分子进行测序，进而确定待测SNP位点的基因型。

其中，所述切割-连接反应体系还包括接头二，所述接头二用于与第一粘性末端所在末端的相对端连接。

其中，当检测的待测序样本有多个时，根据待测序样本的不同分别进行步骤A和B。

进一步的，所述接头一或接头二含有标签序列，用于识别不同的待测序样本和待测SNP位点的类型。

其中，所述接头一为双链核酸分子，其第二粘性末端所在链的5’末端含生物素标记。

进一步的，所述接头一被预先固定在含链霉亲和素标记的磁珠上。

其中，步骤A中PCR扩增使用的聚合酶为Taq酶。