[发明专利]一种利用CRISPR/Cas系统在猪胚胎细胞中实现基因敲除的方法

权利要求书

1.一种在体外利用CRISPR/Cas系统在猪胚胎细胞中实现基因敲除的方法，包括下述步骤：

(1)、构建Cas9真核表达载体pCDNA3.1(+)-hCas9-NLS，具体过程为：合成hSpCas9 DNA序列，并在C端加入一段NLS，将其克隆到pCDNA3.1(+)真核表达载体，得到Cas9真核表达载体pCDNA3.1(+)-hCas9-NLS；

(2)、构建gRNA表达载体pSicoR-GFP-T7-gRNA，具体过程为：

(a)、合成SEQ ID No.1所示gRNA，合成的两条DNA链，溶解后，各取5μL，再加入1μL 10×LA PCR Buffer，混匀，95℃加热10min，然后置于室温1h，形成带有两个粘性末端的DNA双链；

(b)、pSicoR-GFP载体用XhoI和BamHI酶切，回收载体骨架，然后将步骤(1)所得DNA双链克隆到pSicoR-GFP中，得到pSicoR-GFP-gRNA；

(c)、以pSicoR-GFP-gRNA为模板，以SEQ ID No.8所示的T7-gRNA_F、SEQ ID No.9所示的T7-gRNA_R为引物进行PCR反应；将PCR产物，克隆至pMD18-T载体，得到pMD18-T-T7-gRNA；将pMD18-T-T7-gRNA和pSicoR-GFP载体同时用XhoI和BamHI进行酶切，回收120bp和7.5kb的DNA条带，然后将回收的两段DNA进行连接；连接产物进行转化导入感受态细胞，挑取单克隆细胞菌落，扩大培养，提取质粒pSicoR-GFP-T7-gRNA；

(3)、将目的基因靶序列插入gRNA表达载体pSicoR-GFP-T7-gRNA中；所述目的基因靶序列为ATATGGGAAAATTCCAGCCA；

(4)、将步骤(1)构建的pCDNA3.1(+)-hCas9-NLS和步骤(3)的产物用限制性内切酶线性化，再以线性化的质粒为模板进行体外转录，体外转录分别获得hSpCas9的mRNA和gRNA2#的sgRNA，最终将hSpCas9的mRNA和gRNA2#的sgRNA通过显微注射至猪IVF胚胎细胞的胞质中，实现敲除；

其中获得gRNA2#的sgRNA的具体过程为：

(ⅰ)、将SEQ ID No. 27和SEQ ID No. 28所示的带有BsmBI粘性末端的2#靶点序列退火组装成DNA双链；

(ⅱ)、再将pSicoR-GFP-T7-gRNA载体用BsmBI进行酶切，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，将约7500bp的目的片段回收，测定浓度，存于-20℃，备用；

(ⅲ)、将步骤(ⅰ)和(ⅱ)的产物进行连接，将克隆的到的载体命名为pSicoR-GFP-T7-gRNA2#；

(ⅳ)、用限制性内切酶DraIII和PsiI将pSicoR-GFP-T7-gRNA2#质粒线性化；其中，

酶切反应体系为pSicoR-GFP-T7-gRNA2# 质粒10 μg，NEB 的 限制性内切酶PsiI 5 μL，10×CutSmart Buffer 10 μL，加超纯水至100 μL，酶切反应条件为37℃反应6h；

(ⅴ)、将线性化的质粒经过乙醇沉淀后，用于体外转录；乙醇沉淀步骤：在酶切产物中，加入0.1倍体积的3M，PH=5.2的醋酸钠，混匀；再加入2倍体积预冷的无水乙醇，混匀，置于-20℃ 30 min；12,000×g离心10 min，去除上清，加入1ml 70%乙醇，12,000 g离心2 min，去除上清，置于超净工作台风干，加超纯水溶解4h以上，备用。