[发明专利]一种利用CRISPR/Cas系统在猪胚胎细胞中实现基因敲除的方法

说明书

本发明一种利用CRISPR/Cas系统在猪胚胎细胞中实现基因敲除的方法，包括下述步骤：构建Cas9真核表达载体；构建gRNA表达载体；将目的基因靶序列插入gRNA表达载体中；将Cas9真核表达载体和插入了目的基因的插入gRNA表达载体用限制性内切酶线性化，再以线性化的质粒为模板进行体外转录，体外转录分别获得hSpCas9的mRNA和gRNA2#的sgRNA，最终将hSpCas9的mRNA和gRNA2#的sgRNA通过显微注射至猪IVF胚胎的胞质中，实现敲除。本发明的方法具有更加敏感有效且成本低，适合更广范围使用的优点。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种利用CRISPR/Cas系统在猪胚胎细胞中实现基因敲除的方法。

背景技术

传统的基因打靶技术，通过构建同源打靶载体，依赖同源重组(HR)来实现对内源基因的定点敲除，其效率非常低，这极大地限制了各类动物模型的建立及分子机制的研究。ZFN的研究，是基因编辑技术的一场革命。ZFN通过特异性地切割DNA，造成DSBs，从而引发细胞自身DNA修复途径——非同源性末端连接(NHEJ)，NHEJ通过随机而的删除/插入(Indel)修复DNA，使得目的基因发生突变。ZFN将传统基因打靶的效率从10^-6提高至20％，但是其结构的特殊性，及其靶点筛选、载体构建的复杂性，限制其在大范围内的使用。TALEN是继ZFN后出现的又一种基因编辑技术，其以高效、构建简单、靶点选择范围广等特点，而备受研究人员的亲睐。

TALEN的出现，使得各种基因敲除的动物及细胞系迅速涌现。而研究人员一直致力于寻找一种更为简易的方法，应用于基因工程。2013年1月份，SCIENCE同时刊登了两篇关于CRISPR/Cas在基因敲除上的应用的文章，这种构建快速、结构简单，高效的分子工具很快便被大家所接受。拟南芥，果蝇，斑马鱼，老鼠，人的细胞等等，各种基因敲除的个体或者细胞如雨后春笋般涌现。

CRISPR/Cas系统如图1所示，主要包括两部分：Cas9蛋白和crRNA:tracrRNA。Cas9蛋白的作用主要是对DNA实行切割，造成DSBs；而crRNA:tracrRNA主要是特异性结合DNA，并引导Cas9对DNA进行切割。crRNA:tracrRNA经过改造，形成更容易构建的嵌合体RNA，也称引导RNA(Guide RNA，gRNA)而其效率并不受影响。这门技术已经越来越广泛地被大家所接受和利用。

发明内容

本发明的目的在于公开了一种利用CRISPR/Cas系统在猪胚胎细胞中实现基因敲除的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种利用CRISPR/Cas系统在猪胚胎细胞中实现基因敲除的方法，包括下述步骤：

(1)、构建Cas9真核表达载体pCDNA3.1(+)-hCas9-NLS；

(2)、构建gRNA表达载体pSicoR-GFP-T7-gRNA；

(3)、将目的基因靶序列插入gRNA表达载体pSicoR-GFP-T7-gRNA中；

(4)、将步骤(1)构建的pCDNA3.1(+)-hCas9-NLS和步骤(3)的产物用限制性内切酶线性化，再以线性化的质粒为模板进行体外转录，体外转录分别获得hSpCas9的mRNA和gRNA2#的sgRNA，最终将hSpCas9的mRNA和gRNA2#的sgRNA通过显微注射至猪IVF胚胎的胞质中，实现敲除。

上述技术方案所述的利用CRISPR/Cas系统在猪胚胎细胞中实现基因敲除的方法，其中，步骤(1)的具体过程为：合成hSpCas9 DNA序列，并在C端加入一段NLS，将其克隆到pCDNA3.1(+)真核表达载体，得到Cas9真核表达载体pCDNA3.1(+)-hCas9-NLS。