[发明专利]一种三元复合体系检测探针的构建方法

权利要求书

1.一种构建三元复合体系检测探针的方法，三元复合体系包含适配体，过氧化物酶模拟片段和核酸链式反应单元；

该方法能实现操作简单、灵敏快速，无需使用信号分子标记，对检测信号多级放大的目的，并对小分子，如赭曲霉毒素A进行灵敏检测；

其特征是：待测分子首先与核酸链H₁反应，使H₁的空间结构改变，由首尾相连的“发夹”结构变为直链结构，再加入核酸链H₂，由于直链结构的H₁序列中含有能与核酸链H₂反应的碱基序列，碱基互补配对后使核酸链H₂空间结构由“发夹”结构变为直链结构，能够再与核酸链H₁反应，经循环反应后，形成长链的H₁-H₂互补双链DNA结构；

再加入含过氧化氢的四甲基联苯胺溶液进行显色，由于每个核酸链H₂包含过氧化物酶模拟片段，在氯化血红素存在时，能够催化过氧化氢氧化四甲基联苯胺，产生有色物质，根据溶液吸光度与待测分子浓度间关系，可以得到其检测曲线。

2.根据权利要求1所述一种构建三元复合体系检测探针的方法，其特征在于按照下述步骤进行：

（1）首先选取能与小分子赭曲霉毒素A作用的DNA片段（适配体），根据适配体碱基序列，设计能与其形成分子内杂交互补的片段，连接到适配体的3’末端，形成三元复合体系中的探针H₁；

（2）根据H₁ 3’端的碱基序列，设计能够与其杂交互补的片段a，同时寻找能与a形成分子内杂交互补的片段b，连接到其5’末端，再选取能模拟过氧化物酶的碱基片段c，将以上三个片段依从3’端到5’端分别为a-c-b的顺序排列，形成三元复合体系中的探针H₂；

（3）小分子赭曲霉毒素A与H₁的反应：取一定量含有赭曲霉毒素A的待测溶液，在其中加入H₁水溶液，使H₁终浓度为1-100 nM，然后加入10微升CaCl₂水溶液和10微升 KCl水溶液，使CaCl₂终浓度为10 mM，KCl终浓度为20 mM，最后加入10微升氯化血红素水溶液，使氯化血红素终浓度为150 nM，混合均匀，反应10分钟；

（4）加入H₂后的链增长：在前述（3）的溶液中接着加入H₂水溶液，使H₂终浓度为1-100 nM，充分混合均匀后，反应60分钟；

（5）显色过程：在前述（4）的溶液中加入80微升含有H₂O₂的四甲基联苯胺溶液，使最终H₂O₂和四甲基联苯胺的浓度分别为0.03%和0.2微g/mL；

最后反应60分钟后，加入50微升1 M的盐酸，5分钟后测定波长为450纳米处的吸光度；绘制吸光度与待测溶液中赭曲霉毒素A的浓度关系曲线；

（6）赭曲霉毒素A的检测：取可能含有赭曲霉毒素A的食品（如面粉）1克，加入甲醇10mL，搅拌5分钟后，将溶液离心，吸取上部溶液5微升，再加入45微升水，作为实际样品（待测溶液）；

重复上述（3）（4）步骤，以及（5）步骤中除去绘制绘吸光度与待测溶液中赭曲霉毒素A的浓度关系曲线的其余步骤；

将得到的吸光度值与（5）中得到的浓度关系曲线进行对比，得到对应的赭曲霉毒素A的浓度，实现样品中赭曲霉毒素A的检测，从而实现一种三元复合体系检测探针方法的构建。

3.根据权利要求2所述的一种构建三元复合体系检测探针的方法，其特征在于其中所述的DNA片段H₁如SEQUENCE  LISTING1所示。

4.根据权利要求2所述的一种构建三元复合体系检测探针的方法，其特征在于其中所述的DNA片段H₂为所述的H₂如SEQUENCE  LISTING2所示。

5.根据权利要求2所述的一种构建三元复合体系检测探针的方法，其特征在于其中所述的三元复合体系检测探针在检测赭曲霉毒素A的应用。