[发明专利]一种三元复合体系检测探针的构建方法

说明书

技术领域

本发明专利涉及一种构建三元复合体系检测探针的技术，可用于对赭曲霉毒素A进行灵敏检测。特点在于利用适配体、核酸碱基互配和核酸链连续互补，对检测信号放大，属于生物传感领域。

背景技术

赭曲霉毒素A是一种常见的霉菌毒素，广泛存在于霉变的水果和谷物中。其毒性主要是肾脏毒性、肝脏毒性、免疫毒性、致畸毒性和致癌性。

目前，赭曲霉毒素A在食品中的检测手段多为生物鉴定法、化学分析法以及仪器分析法。其中生物鉴定法主要用于定性判断真菌毒素的存在与否，其缺点在于灵敏度不高。化学分析法对操作人员技术要求不高，但结果重现性差。目前常用的仪器分析法包括高效液相色谱法和质谱法，具有灵敏度高、重现性好的优点，但所用仪器昂贵，对操作人员技术要求高，且用到大量有机溶剂，因此不利于推广使用。近年来，抗体技术在构建大分子探针，如蛋白质的检测方面有许多应用，但一些小分子，如赭曲霉毒素A，相应的抗体难以制备，且亲和力弱，因此不利于灵敏度高的检测探针的制备。发展简便、灵敏、快速、高效的小分子检测探针对于食品安全的保障具有重要意义。

核酸适配体的使用能够在一定程度上解决这一难题。适配体是一段能与待检测分子通过构型互补，改变三维结构、实现对待测分子高亲和性、高特异性结合的一段寡核苷酸序列。与抗体相比，其具有以下优势：(1)靶分子的分子量更广，包括大分子量的蛋白质，核酸，小分子量的无机、有机化合物；(2)能够通过核酸构象的改变，实现对靶分子的高亲和性结合；(3)适配体可以人工合成，且性质稳定，因此适配体在小分子检测探针的构建中具有非常好的应用前景。尽管目前有利用适配体构建检测探针的报道，但构建三元体系，利用三元体系中适配体对小分子的识别作用，过氧化物酶模拟单元实现对检测信号的免标测定，并结合核酸链式反应对信号的放大效应进行检测探针的构建，用于小分子的检测尚未见报道。

本项目中，我们利用了核酸适配体和核酸链式反应原理，设计了两条核酸序列H₁和H₂，在不含有待测目标分子时，二者初始构象为首尾相连的“发夹”结构，H₁不能与H₂结合，而当目标分子存在时，包含适配体的探针分子H₁“发夹”结构能够打开，暴露出与H₂碱基互补的DNA片段，进而通过与H₂的结合，使H₂的“发夹”结构打开，H₂包含能够在 氯化血红素存在时催化过氧化氢氧化四甲基联苯胺，产生有色物质的DNA片段(过氧化物酶模拟片段)。发夹”结构打开后的H₂又可以与H₁碱基互补，进而引发新的H₁片段“发夹”结构打开，通过多轮循环反应，可以实现检测信号的放大。基于此，构建了包含适配体，过氧化物酶模拟片段和核酸链式反应单元的三元复合体系检测探针，能够用于小分子，如赭曲霉毒素A的检测。

发明内容

技术问题：本发明提供一种基于适配体，过氧化物酶模拟片段和核酸链式反应三元体系的构建方法，能实现操作简单、灵敏快速，无需使用信号分子标记，对检测信号多级放大的目的，并对小分子，如赭曲霉毒素A进行灵敏检测。首先，设计出DNA片段H₁(H₁含有可识别待测分子(本项目以赭曲霉毒素A为例)的适配体)和DNA片段H₂，(H₂含有能在氯化血红素存在时催化H₂O₂氧化四甲基联苯胺产生有色物质的片段(过氧化物酶模拟片段))，二者初始结构为首尾相连的“发夹”结构。在没有加入赭曲霉毒素A前，H₁由于内部碱基互补，产生“发夹”结构，首尾相连，不能与DNA片段H₂作用，当赭曲霉毒素A加入后，由于适配体与赭曲霉毒素A作用后，空间结构改变，使“发夹”结构打开，能够与DNA片段H₂的一端互补，诱导原来为“发夹”结构的H₂打开，进而再与H₁作用，经过循环反应后，能够形成含有大量过氧化物酶模拟片段的长链DNA，通过加入含有H₂O₂的四甲基联苯胺溶液，使检测信号放大。