[发明专利]构建稳定表达细胞池并进行蛋白表达生产的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种构建稳定表达细胞池并进行蛋白表达的方法，特别是涉及一种运用特异 重组酶介导的靶向插入技术(Recombinae-MediatedCassetteExchange,RMCE)在宿主细胞中 构建稳定表达细胞池并进行蛋白表达生产的方法。

背景技术

近年来，以单克隆抗体药物为代表的生物制药市场快速扩张。而在这些产品中，超过80％ 的外源蛋白是在哺乳动物生产细胞系中进行表达。中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系是这类细胞 中运用最多最成功的一个例子。

在传统方法中，外源基因和必要的转录调空元件，与一个选择基因一同转入到宿主细胞 中并随机插入到宿主染色体中。通过加入与选择基因所对应的抗生素或者重要代谢酶的缺失 来严格选择细胞系，其中稳定和高效是考量细胞建系成功与否的重要因素。这种方法的局限 在于：(1)由于随机插入的不可预知性和不可控制性，外源基因的表达水平往往有很大的区 别(positioneffect)；(2)由于外源基因表达水平的不稳定性，需要通过筛选大量的克隆才 能得到高效表达的细胞系；工业上运用传统方法制备细胞系，往往需要6-12个月以上的时间； (3)一同插入的选择基因可能对所要表达的外源基因有抑制作用，或者破坏在插入点外围内 源基因的正常表达；在培养基中加入抗生素，也会增加工业发酵生产中抗生素污染的风险； (4)外源基因往往是以多拷贝的形式插入进宿主染色体组，容易引起拷贝间的重组进而导致 染色体组的突变，或者引起重复基因诱导的基因沉默；(5)载体骨架DNA与外源基因一同 插入宿主染色体中，载体DNA中富含的CpG岛会导致基因沉默。

而特异重组酶介导的靶向插入技术(Recombinae-MediatedCassetteExchange,RMCE)是 在Flp重组酶的作用下，外源抗体基因盒定点插入到已表征过的高效稳定的基因组位点上， 从而实现稳定细胞池/株的快速构建。与传统细胞构建体系相比，该技术在高效表达位点的重 复利用、快速建立稳定表达细胞群/株、降低成本与周期等方面具有显著优势。其技术优势主 要体现在以下几个方面：

1)CHO宿主细胞中，能够高效稳定表达报告基因的插入位点。因为该插入位点上只有 单拷贝或低拷贝的报告基因插入，所以该位点是DNA高效转入和蛋白翻译的位点。

2)通过RMCE技术对该高效稳定表达的位点进行反复利用。从而达到快速构建稳定细 胞株的目的。所筛选的稳定细胞株能够遗传前期筛选的高效稳定表达位点的，从而减少克隆 筛选的工作量并提高筛选克隆的成功率。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种构建稳定表达细胞池并进行蛋白表达生产的方法。 该方法利用特异重组酶介导的靶向插入技术(RMCE)能在宿主细胞中快速构建稳定表达细 胞池并进行蛋白表达的生产。

为解决上述技术问题，本发明的构建稳定表达细胞池并进行蛋白表达生产的方法(即在 宿主细胞中快速构建稳定表达细胞池并进行蛋白表达生产的方法)，包括步骤：

在宿主细胞中筛选一株稳定表达报告基因的母细胞株，然后，运用特异重组酶介导的靶 向插入技术在母细胞株中进行外源表达基因和报告基因的置换，以此来构建稳定表达细胞池 并进行外源蛋白表达和生产。

另外，所述方法的具体步骤包括：

1)在宿主细胞中引入报告基因，通过对报告基因的筛选，获得稳定表达报告基因的稳定 细胞株(即母细胞株)；

2)将需要表达的外源表达基因(即外源表达蛋白基因)进行标记，并克隆进一个独立的 载体，作为交换载体；

3)通过上述交换载体和FLP酶表达载体在母细胞株中的共转染，在FLP酶的调控下， 实现外源表达基因和报告基因间的置换，从而构建了稳定表达的细胞池并能进行外源蛋白表 达和生产。

所述步骤1)中，宿主细胞优选为CHO-K1宿主细胞；引入报告基因的个数优选为1个； 另外，报告基因的两端由一对异种特异性的FLP-recombinasetarget(FRT)sites来标记。

所述步骤2)中，标记的方法优选采用步骤1)中的一对异种特异性的FLP-recombinase target(FRT)sites来标记；所述外源表达基因包括：外源抗体蛋白表达基因；所述载体包括： 质粒等。