[发明专利]一种在毕赤酵母和汉逊酵母中进行异源蛋白表达的通用载体的构建与应用

权利要求书

1.一种在毕赤酵母和汉逊酵母中进行异源蛋白表达的通用载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤（1），用限制性内切酶BglⅡ和BamHⅠ双酶切质粒pHanMOX-GFP，得到pHan载体；

步骤（2），用限制性内切酶BglⅡ和BamHⅠ双酶切消化载体质粒pPinkAOX1-HPV16L1，回收片段P_AOX1-HPV16L1-CYC1TT后与步骤（1）所得pHan载体以T4连接酶16℃连接过夜，转化并涂布含0.1mg/mL卡那霉素的LB平板，提取质粒酶切鉴定，得到重组汉逊酵母质粒pHanAOX1-HPV16L1，该质粒即为通用载体。

2.根据权利要求1所述的在毕赤酵母和汉逊酵母中进行异源蛋白表达的通用载体的构建方法，其特征在于，所述的步骤（1）中的酶切反应体系为质粒pHanMOX-GFP 0.25μg/μl 20微升，BglⅡ 1微升，BamHⅠ1微升，10×K buffer 5微升，双蒸水23微升。

3.根据权利要求1所述的在毕赤酵母和汉逊酵母中进行异源蛋白表达的通用载体的构建方法，其特征在于，所述的步骤（2）中的酶切反应体系为质粒pPinkAOX1-HPV16L1 0.35μg/μl 20微升，BglⅡ 1微升，BamHⅠ1微升，10×K buffer 5微升，双蒸水23微升。

4.根据权利要求1所述的在毕赤酵母和汉逊酵母中进行异源蛋白表达的通用载体的构建方法，其特征在于，所述的连接反应体系为P_AOX1-HPV16L1-CYC1TT片段 2微升，pHan载体1.26微升，10×T4 buffer 1微升，T4连接酶 0.5微升，双蒸水5.24微升；其中，所述的P_AOX1-HPV16L1-CYC1TT片段与pHan载体的连接摩尔浓度比为1:3。

5.根据权利要求1所述的在毕赤酵母和汉逊酵母中进行异源蛋白表达的通用载体的构建方法，其特征在于，所述的含0.1mg/mL卡那霉素的LB平板包括以下物质：每升含胰蛋白胨10克，酵素提取物5克，氯化钠10克和琼脂粉15克；还包括终浓度为0.1mg/mL的卡那霉素，其溶剂为双蒸水。

6.根据权利要求1所述的在毕赤酵母和汉逊酵母中进行异源蛋白表达的通用载体的构建方法，其特征在于，所述的提取质粒酶切鉴定的具体操作方法为，质粒pHanAOX1-HPV16L1用限制性内切酶SacⅠ于37°C水浴锅中酶切1小时候，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后，显示于2470个碱基长度的地方有一条带则表明质粒构建正确，其中酶切鉴定反应体系为：质粒pHanAOX1-HPV16L1 0.36μg/μl 2微升，SacⅠ0.2微升，10×L buffer 1微升，双蒸水6.8微升。

7.权利要求1-6任意一项构建的重组汉逊酵母质粒pHanAOX1-HPV16L1在指导人乳头瘤病毒16型主要衣壳蛋白L1表达中的应用。

8.根据权利要求7所述的重组汉逊酵母质粒pHanAOX1-HPV16L1在指导人乳头瘤病毒16型主要衣壳蛋白L1表达中的应用，其特征在于，重组汉逊酵母质粒pHanAOX1-HPV16L1转化毕赤酵母和汉逊酵母来指导人乳头瘤病毒16型主要衣壳蛋白L1表达，具体方法为：重组汉逊酵母质粒pHanAOX1-HPV16L1经限制性内切酶AflⅡ消化后转化毕赤酵母，重组克隆子经过无博来霉素加压的连续培养后再经博来霉素加压筛选的过程，随机挑取6个单克隆重组子经甲醇诱导表达人乳头瘤病毒16型主要衣壳蛋白L1蛋白。

9.根据权利要求8所述的重组汉逊酵母质粒pHanAOX1-HPV16L1在指导人乳头瘤病毒16型主要衣壳蛋白L1表达中的应用，其特征在于，指导人乳头瘤病毒16型主要衣壳蛋白L1的表达方法为：

汉逊酵母重组质粒pHanAOX1-HPV16L1经AflⅡ线性化后电转化毕赤酵母Pink^TMStrainⅠ及汉逊酵母细胞，涂布含0.2mg/mL博来霉素的酵母浸出粉胨葡萄糖平板，分别于30℃和37℃培养；待菌落长出后，分别从四个平板上各挑取3个菌落进行非抗性压力下的连续传代，共重复转接培养5次，将第六次转接培养24小时后的菌液于含0.2mg/mL博来霉素的酵母浸出粉胨葡萄糖平板划线，培养后分别随机挑取各平板上的6个菌落进行诱导表达，诱导24小时后的酵母培养物进行蛋白免疫印迹检测人乳头瘤病毒16型主要衣壳蛋白L1的表达。