[发明专利]一种在毕赤酵母和汉逊酵母中进行异源蛋白表达的通用载体的构建与应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及构建基于甲醇营养型汉逊酵母和毕赤酵母的通用载体，通过考察汉逊酵母核糖体DNA和自主复制序列以及毕赤酵母醇氧化酶1型启动子、翻译延伸因子1-α启动子，和汉逊酵母甲醇氧化酶启动子在穿梭载体中的作用，构建基于汉逊酵母核糖体DNA以及毕赤酵母启动子的能于汉逊酵母和毕赤酵母中穿梭表达的通用载体的方法。

背景技术

甲醇营养型酵母毕赤酵母和汉逊酵母是两个异源蛋白表达宿主系统。它们不仅具有分泌效率高和翻译后蛋白修饰的真核表达系统特点，并且还具备基因操作容易、在简单培养基中快速生长以及不产生内毒素和病毒DNAs的优势。这两个宿主系统均具有细胞生长高密和蛋白高产量的特点，因此适合于工业大规模生产重组蛋白。

近些年，由于汉逊酵母所具备的的优势特性，如生长温度高、生长速率快、蛋白表达高效，已成为国际上公认的理想的外源基因表达系统之一。在汉逊酵母中，外源DNA整合于酵母染色体基因组中，随染色体有丝分裂而复制，稳定存在于染色体上，因此异源蛋白获得在宿主内的稳定表达。这种整合可以是同源重组整合或随机整合。在同源重组中，引入的外源DNA序列必须与汉逊酵母基因组具有同源序列，而由于重组方式和重组位点的不同将会导致重组转化子性质相异。为了使重组蛋白稳定而高效地表达，重组质粒必须高拷贝地整合入酵母基因组中。在汉逊酵母中，高拷贝的基因组整合质粒可以通过高频率的同源或非同源重组的方式获得。

核糖体DNA序列已成功介导了重组质粒在广泛的异源宿主系统中的整合。而这样的整合主要得益于核糖体DNA保守的结构以及在基因组一个或多个位点上头尾相接的串联重复排列模式。核糖体DNA重复排列的数目和长度在不同的种属里变化很大。在汉逊酵母中一个8.1k碱基对长的单元可以在单一染色体基因组上具有50至60个拷贝。而汉逊酵母核糖体DNA的组成和顺序同酿酒酵母中的核糖体DNA单元非常相似。每一个核糖体DNA单元均由以下几个元件顺序构成，分别是非转录间隔区1，5SrRNA，非转录间隔区2，35S前体序列，外部转录间隔区，18S，5.8S和25S rRNA序列。这样的保守性给汉逊酵母提供了一个基于核糖体DNA的表达平台，扩大了汉逊质粒在不同酵母宿主间指导蛋白表达的能力，例如植酸酶酵母。在植酸酶酵母中，核糖体DNA靶向的载体能够共整合多达3个不同的表达质粒，而这仅仅只通过一次转化步骤。

除了汉逊酵母核糖体DNA外，先前的研究显示汉逊酵母自主复制序列也可用于外源基因的高拷贝整合。自主复制序列又称为复制起点序列，作为顺式作用元件，是真核生物中一类能启动DNA复制的序列，是染色体正常起始复制所必需的。自主复制序列DNA具有一段富含AT的200个碱基对的保守序列，真核生物染色体上有多个自主复制序列。在汉逊酵母中，携带有汉逊酵母自主复制序列的质粒可以高效地转化汉逊酵母，并且可以在体外以自我复制的形式游离稳定存在。

相比于汉逊酵母而言，毕赤酵母较难获得高拷贝的整合，而这样高拷贝的整合发生的几率仅仅为1％。

毕赤酵母和汉逊酵母均为甲醇营养型酵母。它们使用甲醇作为唯一的碳源用于异源蛋白的表达，并且分别受到严格的甲醇调控启动子醇氧化酶1型启动子和甲醇氧化酶启动子的调控。两个启动子均是较强的启动子并且在两个宿主表达系统中均应用广泛。两个启动子均具有相同的调控机制。当酵母细胞在抑制性碳源，如葡萄糖、甘油和乙醇中生长时，醇氧化酶1型启动子在毕赤酵母中同甲醇氧化酶启动子在汉逊酵母中一样均没有活性；当去除了抑制性碳源加入甲醇后，两个启动子均能被强烈地诱导，显示出较高的活性。

与诱导型启动子比起来，由于不需要诱导并且容易操作，组成型启动子在指导异源蛋白表达上得到了广泛的应用。毕赤酵母翻译延伸因子1-α启动子是近年发现的较强的组成型启动子。翻译延伸因子1-α启动子可以使用广泛的碳源对异源蛋白的表达进行调控，碳源如葡萄糖、甘油、甲醇和其它碳源，而指导异源蛋白表达显示出了生长相关的调控模式。使用植酸酶酵母的翻译延伸因子1-α启动子成功指导了绿色荧光蛋白在汉逊酵母中的表达，而毕赤酵母翻译延伸因子1-α启动子在汉逊酵母中的应用却还没有报道。但毕赤酵母醇氧化酶1型启动子也早已在汉逊酵母中应用，如使用毕赤酵母醇氧化酶1型启动子在汉逊酵母中表达转化酶可达1克每升的产量。