[发明专利]一种用于提取桑树叶片RNA的提取剂及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种用于提取桑树叶片RNA的提取剂及其应用。

背景技术

分离获得高纯度RNA是进行RNA相关技术研究的基础和关键。桑树叶片富含多酚类和多糖类，在分离过程中会对RNA提取进行干扰。多酚类物质易氧化，氧化后形成的络合物(如醌类)能与RNA稳定结合，导致抽提过程中RNA的损失，从而影响RNA的分离纯化。多糖类物质一方面形成胶状物影响RNA的溶解，另一方面对部分酶的抑制作用则影响了提取后RNA的应用。RNA酶的高稳定性也是造成RNA极易降解和分离纯化失败的重要原因。RNA酶在RNA提取过程中有两个重要来源：内源性和外源性。外源性RNA主要来自于提取过程中使用的玻璃、塑料制品和试剂以及操作人员等，而内源性RNA酶则为组织固有，在细胞破碎时释放出来。因此，去除多酚类和多糖类污染并抑制RNA酶活性是提取高质量RNA成败的关键。目前的提取试剂盒和方法主要针对普通植物组织，对含多醣和多酚的组织样品的提取效果不佳。

公开号为CN 102807978 B的中国专利申请公开了一种提取藻类RNA的提取剂及使用方法，是将液氮处理的样品研磨后用提取液抽提。利用氯仿：异戊醇混合液进行抽提后，用高浓度氯化锂离心沉淀。用预冷的70％无水乙醇漂洗；待风干后，无RNA酶水溶解，用RNAse-free DNAse set试剂盒去除DNA；利用醋酸钠和无水乙醇沉淀RNA。在-80℃冰箱保存待用。但其不足之处在于需要额外的除DNA步骤，步骤繁琐，成本较高。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种用于提取桑树叶片RNA的提取剂及其应用。

为了实现本发明的目的，本发明首先提供一种用于提取桑树叶片RNA的提取剂，所述提取剂由Tris-HCl，NaCl，EDTA，SDS和巯基乙醇，溶于RNAse固相清除剂水溶液中而成；其中，Tris-HCl的终浓度为0.05-0.2mol/L，NaCl的终浓度为0.25-1.0mol/L，EDTA的终浓度为0.01-0.04mol/L，SDS的终浓度为1％-4％，巯基乙醇的终浓度为2％-8％；所述RNAse固相清除剂水溶液的质量分数为0.1％-0.2％。

进一步地，所述提取剂的制备方法为：向Tris-HCl、NaCl、EDTA和SDS中加入质量分数为0.1-0.2％的RNAse固相清除剂水溶液，室温下静置，使用前每1mL提取剂加入20-80uL巯基乙醇。

本发明进一步提供一种桑树叶片RNA的提取方法，所述提取方法为将桑树叶片样品利用前述提取剂进行RNA的提取。

进一步地，所述方法包括下面步骤：

步骤a)处理样品：取新鲜或超低温冷冻的桑树叶片与聚乙烯吡咯烷酮混合均匀，在液氮中研磨至粉末状；

步骤b)配制权利要求1-3任一项所述的提取剂；

步骤c)抽提：将步骤a)的粉末样品倒入盛有提取液的离心管中，涡旋混匀，离心取上清，加入等体积水饱和酚：氯仿：异戊醇的混合液，涡旋混匀，离心取上清，再加入等体积氯仿：异戊醇混合液，剧烈震荡，室温混匀，离心；

步骤d)吸取：取步骤c)上层清液加入等体积的6M氯化锂，混匀静置，得粗样品；

步骤e)沉淀：将步骤d)静置后的粗样品离心弃上清，用2M氯化锂漂洗后离心弃上清；

步骤f)重悬：加入预冷的乙醇，重悬，离心弃上清，得到沉淀即为桑树叶片RNA。

更为具体地，所述方法包括下面步骤：

步骤a)处理样品：取新鲜或超低温冷冻的桑树叶片与聚乙烯吡咯烷酮混合均匀，在液氮中研磨至粉末状；

步骤b)配制权利要求1-3任一项所述的提取剂；

步骤c)抽提：将100mg步骤a)的粉末样品倒入盛有1mL提取剂的离心管中，涡旋混匀；12000rpm，4℃，离心10min；取上清，加入等体积水饱和酚：氯仿：异戊醇的混合液，涡旋混匀。15000rpm，4℃，离心15min；取上清，加入等体积氯仿：异戊醇混合液，剧烈震荡，室温混匀20min。15000rpm，4℃，离心10min；

步骤d)吸取。取步骤c)上层加入等体积6M氯化锂，轻轻混匀，-80℃静置5h/-20℃过夜，得粗样品；

步骤e)沉淀：将步骤d)静置后的粗样品离心，15000rpm，4℃，离心30min；弃上清，用400μL 2M氯化锂漂洗，15000rpm，4℃，离心20min，弃上清；