[发明专利]一种双功能脂肪酶突变体及其在面制品加工中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种双功能脂肪酶突变体及其在面制品加工中的应用，具体地说涉及利用分子生物学技术获得性质提高的脂肪酶突变体，该突变体适用于面制品加工领域，属于酶的基因工程技术领域。

背景技术

酶制剂作为一种蛋白质产品，基于其独特的生物学特性，使得其在烘焙和面粉品质改良方面具有其他化学成分无法替代的作用。目前，在面制品加工中使用酶制剂已经成为一种主流的趋势。

在面包烘焙过程中使用的面粉含有甘油磷脂和甘油三脂，若将甘油磷脂部分水解生成溶血甘油磷脂，甘油三脂部分水解为甘油单酯或者甘油二酯，溶血甘油磷脂、甘油单酯和甘油二酯作为表面活性剂能够起到乳化作用，对面团有强筋作用，能够提高面包的入炉急胀，增大面包体积，使其组织细腻均匀，包心柔软，口感更好。因此在面包烘焙加工中在面粉中加入具有卵磷脂和甘油三脂分解活性的酶就能够起到上述的作用。另外在馒头等面制品加工过程中，由于面粉中含有叶黄素和叶红素等色素，影响了面制品白度，因此如果在在面粉中加入能够分解甘油三脂的酶来分解面粉中的脂肪，使得原本溶于脂肪中的色素被释放出来，更加易于被氧化褪色，从而对面制品起到增白的作用。

在前期研究中，发明人成功从酿造浓香型大曲酒的酒曲中筛选到一株高产脂肪酶的华根霉(Rhizopus chinensis)CCTCC M 201021菌株，并从该菌株中首次克隆得到脂肪酶基因序列，并实现该脂肪酶在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中的高水平分泌表达(Yu Xiao-Wei et al.J Mol Catal B:Enzym,2009,57:304-311)；以华根霉脂肪酶基因为模板，利用定向进化技术获得了一系列热稳定性提高的突变体(授权专利CN 101974499B；Yu Xiao-Wei et al.Microbial Cell Factories,2012,11:102-112)。在此基础上，本研究利用分子生物学的手段对华根霉脂肪酶进行基因突变，获得具有甘油三酯与卵磷脂水解活性的耐热脂肪酶突变体，该突变体在面制品加工中具有很好的应用效果，在馒头等面制品加工中起到显著增白、在面包烘焙加工中起到显著增大比容的效果。授权专利CN 102160562B中已经公开利用本研究亲本脂肪酶作为面包添加剂提高面包的烘焙特性，本项目提供了一种性质更加优良的脂肪酶突变体，用于面包、馒头等面制品的加工工艺中。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种脂肪酶突变体，其氨基酸序列如下：

1)所具有的氨基酸序列与SEQ NO.1所示亲代氨基酸序列相比，存在下列氨基酸取代形式：突变体1：P298T；突变体2：P298T/H317P；突变体3：P298T/H317P/V326S；突变体4：P298T/T218S/S234F；突变体5：P298T/H317P/P168L/A129S；突变体6：P298T/S234F/K161R/V326S；

2)在1)限定的核苷酸序列基础上经碱基的缺失、取代、插入或突变，同源性达到80％以上的核苷酸序列；具有甘油三酯与卵磷脂水解活性，且热稳定性好。

所述突变体的热稳定性比亲代在40℃下半衰期比亲本脂肪酶高了14～38倍。

本发明要解决的另一个技术问题是提供一种含有上述脂肪酶突变体的基因工程菌及其构建方法。含编码所述脂肪酶突变体的DNA序列、及其基因工程菌或转基因细胞系亦是本发明要求保护的范围。

所述基因工程菌为重组毕赤酵母GS115，KM71或SMD1168，其中优选GS115。

本发明解决的另一个技术问题为提供一种构建上述基因工程菌的方法，通过选取重组毕赤酵母表达载体pPIC9，pPIC3K，pPIC9K，pAO815或pPICZα，更优选pPIC9构建重组表达载体，以毕赤酵母GS115为宿主进行表达。

上述脂肪酶突变体在面制品加工中的应用也属于本发明要求保护的范围，所述面制品为面包、馒头、面条。

脂肪酶突变体的标识

采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示脂肪酶突变体中突变的氨基酸。如S234F，表示位置234的氨基酸由亲本脂肪酶的Ser替换成Phe，位置的编号对应于附件序列表1中亲本华根霉脂肪酶RCL的氨基酸序列编号。

如L180H/T128S，表示位置180和位置218的氨基酸都发生了突变。