[发明专利]用于单分子分析的方法

说明书

相关申请的交叉参考

本发明要求于2013年2月5日提交的美国临时申请第61761,189号的权益，其全部内容通过引用并入本文。

背景

技术领域

本发明涉及纳米技术领域和单分子基因组分析领域。

相关技术描述

新一代测序(NGS)技术能够使序列数据能够高通量和低成本生成。然而，从头组装基因组仍然是一项巨大的挑战，特别是对于大型基因组而言。NGS短读数(shortread)往往不足以创建跨越重复序列并促进精确装配的重叠群。植物基因组由于其含有大量重复元件而臭名昭著，所述元件与庞大的基因组大小组合，使得这些庞大且复杂的基因组的精确装配变得棘手。

尽管高通量测序进步，序列读取的精确从头组装代表基因组计划中的薄弱环节[1,2]。基因组序列组装有两个通用步骤，生成序列重叠群和支架，以及将它们锚定到全基因组的低分辨率图谱上。NGS平台生成范围从25至多于500个碱基的序列读数[3]，而通过Sanger测序，能够高精确地获得多达1000个碱基的读数。NGS读数对于精确组装而言往往太短。配对末端读数可以桥接重叠群成支架，但支架内经常存在间隙。为指定重叠群和支架，需要来自独立技术平台的高分辨率基因组图谱。它们可以是染色体尺度，即遗传图谱，或区域尺度，即细菌人工染色体(BAC)或粘粒的重叠群[4]。如果重叠群和支架相比图谱分辨率太短，则难以映射它们。例如，图谱可具有50-150kb的分辨率，而许多重叠群和支架可能只跨越几个千碱基。此外，重叠群和支架本身也有错误，往往是由于重复序列的错误组装所致。典型的中型到大型基因组含有40-85％的重复序列[5-8]，极大地阻碍了有效地从头组装序列。

基因组精加工(genomefinishing)一直依赖于庞大复杂的基因组物理图谱的指导，包括人类、拟南芥[9]、水稻[10]和玉米[11,12]。复杂基因组的基于BAC的限制性片段物理作图十分强健，因为甚至在沿BAC插入物(通常长100-220kb)存在散布的重复序列的情况下，也生成限制性片段的唯一模式。构建物理图谱的现有技术状态包括快照(SNaPshot)[13,14]、全基因组概况分析(wholegenomeprofiling)[15,16]、光学作图[17,18]以及基因组作图[19]。快照是使用一种或多种限制酶和荧光标记随后通过毛细管电泳分离片段的限制性指纹分析方法。快照已用于小麦和其他基因组的物理作图[14,20]。光学作图通过保持限制性位点沿固定在表面上的DNA分子的物理顺序提供信息的附加层[18]。它已被应用于玉米和水稻基因组[11,21]。人们可以通过比较电子序列基序图谱(sequencemotifmap)与共有序列光学图谱来验证序列组装[22-25]。然而，光学图谱的信息密度仅为每20kb约一个位点，并且该技术由于高错误率、非均匀DNA线性化以及低通量而实用性有限。因此，非常需要一种能够克服光学作图的这些限制的与作图无关的高分辨率(例如，<5kb)DNA测序。

发明概述