[发明专利]蛋白质纯化方法

说明书

一种用于从蛋白质制剂纯化期望蛋白质的方法，其包括：通过用可溶性有机多价离子、固定化有机多价离子或两者处理，任选地在过饱和尿囊素的存在下处理，由此来调节蛋白质制剂，从而移除至少90％的染色质，然后(1)在大于生理浓度的非蛋白质沉淀盐的存在下用非离子性有机聚合物沉淀期望蛋白质以提供期望蛋白质的沉淀物；或(2)在不存在大于生理浓度的非沉淀盐的情况下用非离子性有机聚合物沉淀期望蛋白质以提供沉淀物，随后在大于生理浓度的非蛋白质沉淀盐的存在下用非离子性有机聚合物洗涤沉淀物。

相关申请的声明

本申请要求2013年2月6日提交的美国临时申请号61/761,646、2013年2月14日提交的61/764,966、2013年6月4日提交的61/831,099、2013年7月29日提交的61/859,772和2013年11月22日提交的61/907,877的优先权，其各自以全文引用的方式并入本文中。

背景技术

重组蛋白的纯化通常从净化步骤开始，其中移除细胞和碎片，使得可以用原本会因细胞和碎片的存在而受阻碍或变得无效的方法处理剩余上清液。所述移除通常涉及物理方法，例如离心和微滤。有时涉及使用具有阴离子交换能力的薄膜或深层过滤器，或直接向含抗体的采集物中加入阴离子交换聚合物或粒子(Gagnon,P.,Purification Tools forMonoclonal Antibodies,Validated Biosystems,Tucson,1996；Kuczewski,M.等人,Biopharm Int.23(3)(2010)20-25；Kuczewski,M.等人,Biotechnol.J.,6(2011)56-65)。Gan等人(J.Chromatography A 191(2013)33-40)最近指出，用可溶形式和不可溶形式的多价有机离子针对性地移除染色质分解代谢产物特别支持对细胞培养采集物的有效调节。物理净化方法通常无法实现显著的染色质减少。向采集物中加入阴离子交换粒子典型地移除大约一半的DNA。Gan等人(上文)所描述的一些方法移除99％的染色质，并且可以精确地被认为是针对染色质的净化方法。

已经描述了通过用聚乙二醇(PEG)沉淀来纯化蛋白质。其典型地作为水相技术来执行，其中PEG溶于水性蛋白质制剂中并且引起蛋白质从该溶液中沉淀出来。PEG的尺寸和浓度是已知的工艺参数，pH也是一样(Gagnon1996上文；D.Atha,K.等人J.Biol Chem.,256(1981)12108-12117；美国专利申请公开号2008/0214795，其各自以引用的方式并入本文中)。操作pH越接近抗体的等电点，实现沉淀所需的PEG浓度就越低。已指出非蛋白沉淀盐如氯化钠(NaCl)的浓度对选择性几乎没有显著影响(Atha等人,上文)，但是所述技术已经在高达约1.7M浓度(10％)的NaCl的存在下执行(Gervais等人,美国专利申请公开号2010/0204455)。也已经证实了当PEG与高浓度的NaCl组合时，由PEG介导的空间排阻色谱实现更高的IgG回收率和更低的污染物含量，并且进一步注意到其在很大程度上抵消了pH的影响(P.Gagnon等人,J.Chromatogr,A 1324(2014)171-180)。也已经描述了将PEG与蛋白质沉淀盐磷酸钠组合(Gervais,上文；美国专利号4,379,086和4,515,776)。

在使沉淀物再溶解之后移除残余PEG对于所述技术来说是一项重大挑战。Kuczewski等人(上文)通过在其中IgG结合于阳离子交换柱而在PEG流过的条件下进行阳离子交换色谱来移除残余PEG。PEG的移除原本是复杂的，因为其占据与其被用于沉淀的蛋白质相同的尺寸范围(作为流体动力学半径或直径测量)。这导致尺寸排阻色谱、透析和渗滤的标准方法无法用于PEG移除。针对IgG单克隆抗体广泛实施的在流过模式下的阴离子交换色谱也不适合，因为PEG与抗体一起流过。

发明内容