[发明专利]用于从蛋白制剂去除内毒素的材料和方法

说明书

一种方法包括：(i)将尿囊素以过饱和量添加至蛋白制剂中，所述蛋白制剂包含所需蛋白和作为污染物的至少一种内毒素，(ii)在所述添加步骤后去除固体以提供样品用于通过柱中正电性粒子的填充粒子床上的空隙排阻色谱进一步纯化，所述填充粒子床具有粒子间体积，(iii)将样品体积施加到所述填充粒子床，其中所述正电性粒子支持空隙排阻色谱,并且其中所述样品体积不大于所述粒子间体积,和(iv)洗脱包含所需蛋白和减少量的内毒素的经纯化样品。所述方法任选地仅利用尿囊素处理或仅利用空隙排阻色谱进行。

相关申请的声明

本申请要求于2013年2月22日提交的美国临时申请号61/768,232的优先权，该申请的全部内容通过引用整体地结合于本文中。

背景技术

本文公开的实施方案涉及用于减小蛋白制剂中的内毒素水平的方法，所述蛋白制剂包括未纯化的、部分纯化的、和高度纯化的制剂。内毒素是源自革兰氏阴性细菌的细胞壁的脂多糖。它们是生物制剂中普遍存在的污染物，其造成了严重的问题，因为它们是广谱细胞毒素，能够混淆研究结果，在诊断测定中得出错误结果，并且使得期望的治疗性产品不能安全的使用。这使得具有将它们从其驻留的生物制剂中去除的有效材料和方法是重要的。已经开发了许多这样的材料和方法。已知的实例包括通过阴离子交换色谱处理制剂，在阴离子交换色谱中在许多情况下内毒素比样品中的所需蛋白更强力的结合(Chen,R.,等，Protein Expression and Purification 2009,64,76-81)。其他已知的实例包括羟磷灰石色谱(Gagnon,P.,等，BioProcess International 2006,4,50-60),固定化金属亲和色谱(Tan,L.,等，Journal of Chromatography A 2007,1141,226-234),利用固定化组氨酸或多粘菌素B的亲和色谱(Anspach,F.,等，Journal of Chromatography A 1995,711,81-92),利用固定化多粘菌素B的亲和色谱，利用固定化的从鲎变形细胞重组得到的内毒素-结合肽的亲和色谱(Ding,J.,等，Journal of Chromatography B 2001,759,237-246)，利用表面活性剂Triton X-113的微分萃取(Cotten,M.,等，Gene Therapy 1994,1,239-246)，和大量的专有商业产品和方法(Kang,Y.,等，Process Biochemistry 2000,36,85-92)；Salema,V.,等，Pharmaceutical Technology Europe 2009,21,36-41)；Clutterbuck,A.,等，Biopharm International 2007,20,24-31)。所有这些方法利用了内毒素的脂质-A和核心多糖区域的特性，脂质-A和核心多糖区域一起参与了强力的疏水相互作用)，金属亲和相互作用，和/或与带正电荷的表面的强力的静电相互作用。已经记载了一种称为空隙排阻阴离子交换(void exclusion anion exchange)的技术用于IgG纯化，该技术也减少内毒素含量(Nian,R.,等，J.Chromatography A 1282(2013)127-132)，与许多以前已知的方法相比其实现了较宽的实用性，因为它适应各种样品，不需要它们提前平衡至特定的色谱条件，以及其实现缓冲液交换与去除内毒素相结合的能力。已经记载了一种采用过饱和尿囊素来从蛋白制剂去除内毒素的技术，其具有耐受宽范围的化学条件的特性，所述化学条件包括宽范围的pH、宽范围的盐浓度和有机添加剂(包括表面活性剂)的存在(Vagenende,V.,等，ACS.Appl.Mater.Interfaces 5(2013)4472-4478；Vagenende,V.,等，J.ChromatographyA,1310(2013)127-132)。

发明内容