[发明专利]在非离子有机聚合物和正电性表面存在下的蛋白质纯化

说明书

相关申请的声明

本申请要求2013年2月26日提交的美国临时申请号61/769,416的优先权，该美国临时申请以引用的方式整体并入本文。

背景技术

本文公开的这些实施方案涉及用于纯化包括抗体在内的蛋白质的方法，所述抗体包括IgG单克隆抗体。使用诸如聚乙二醇(PEG)之类的非离子有机聚合物使蛋白质沉淀的技术是已知的。它最常在低盐浓度下，在不添加盐的情况下使用，但是例外情况是已知的(D.Gervais等人的美国专利申请2010/0204455A1；K.Ingham,Arch.Biochem.Biophys.186(1978)106-113；K.Yamamoto等人,Virology,40(1970)734-744；S.Branston等人,Biotechnol.Progr.28(2012)129-136)。

空间排阻色谱的技术是已知的(J.Lee等人,J.Chromatogr.A 1270(2012)162-170；还参见PCT/SG2012/000199，该文献以引用的方式并入本文并且作为附录A随附)。它利用非离子亲水性表面，通过诸如PEG之类的非离子有机聚合物引起所需产物在所述表面上的保留。已经报道NaCl浓度升高会提高病毒结合效率(Lee等人(同上))。已经报道在升高浓度的NaCl存在下在流化颗粒上进行所述技术会提高IgG制剂的回收率和纯度(P.Gagnon等人,J.Chromatogr.A,2014,1324,171-180)。

阴离子交换色谱是已知的，并且广泛地用于蛋白质的纯化。它利用带正电荷的表面，当施用于无盐或少盐的水溶液中时，蛋白质自发地结合在所述表面上。在PEG存在下阴离子交换色谱的性能是已知的，其中与在不存在PEG的情况下相比，PEG的存在使得蛋白质在更高的盐浓度下从填充有多孔颗粒阴离子交换剂的柱中洗脱，并且其中蛋白质越大，则洗脱所述蛋白质所需的盐浓度的增加越大(P.Gagnon等人,J.Chromatogr.A 743(1996)51-55)。

已经描述了用于降低含有单克隆抗体的细胞培养收获物中染色质的含量的方法(H.Gan等人,J.Chromatogr.A,1291(2013)33-40)。染色质已知包括处于被称为核小体的稳定缔合体中的DNA和组蛋白。Gan等人报道了染色质和它的分解代谢物还与抗体形成缔合体，这限制了后续的分级分离方法的功效。他们报道了实现99％的染色质减少的方法，并且进一步报道了这种减少提高了通过阳离子交换色谱所获得的纯化的质量。由Gan等人报道的技术的一种变化方案已经由Gagnon等人(2013，同上)报道以提高通过在流化亲水性颗粒上进行空间排阻色谱所分级分离的IgG的回收率和纯度。

发明内容

本发明提供了一种从制品中纯化所需蛋白质的方法，所述方法包括(a)以在原始产生培养基中存在有少于约5％的染色质的形式提供所述制品；(b)使所述制品与非离子有机聚合物和盐接触，其中非离子有机聚合物的浓度足以使所述所需蛋白质沉淀或使得它附着在亲水性表面上，或将它维持在沉淀的状态或附着在所述亲水性表面上，所述盐浓度足以产生大于生理电导率；以及(c)使所述制品与至少一种正电性表面接触，其中所述所需的蛋白质基本上不吸附到所述至少一种正电性表面上，同时不阻止酸性污染物吸附到所述至少一种正电性表面上，所述接触任选地在足以产生大于生理电导率的盐浓度存在下进行。

具体实施方式

已经惊人地发现在对已经被调节以去除至少95％的染色质的不纯制品进行PEG介导的分级分离方法时，所述PEG介导的方法可以实现比已知的高功能的生物学亲和色谱方法更高程度的蛋白质纯化，并且所述PEG介导的方法包括其中沉淀混合物含有升高浓度的盐的至少一个阶段，以及其中存在至少一种正电性表面的至少一个阶段，以及其中PEG和所需蛋白质的混合物与至少一种正电性表面在相对缺乏盐的情况下发生接触的至少一个阶段。