[发明专利]抗体的原位亲和力成熟作用

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2013年2月27日提交的，美国临时申请号为61/769,856的权益，此处以引用的方式将该案全部并入本申请。

背景技术

单克隆抗体(monoclonal antibody，mAb)目前广泛应用于测定及治疗。抗体疗法是一门价值数十亿元的生意，而要达成有效的治疗与诊断，抗体的抗原结合亲和力非常地重要^1,2。

目前已开发了三种用来创造并筛选单克隆抗体(mAb)的主要技术，包括从经免疫的动物生成融合瘤^3-6、从微生物展示库中筛选出重组抗体^7-10，以及使从人类患者分离得出的B淋巴球不死化(immortalization)^11-13。虽然对转基因动物进行免疫是一种能够生成对抗许多抗原的抗体的有效方法，但还是很难得到对抗T细胞独立型抗原(如肿瘤相关的碳水化合物^14,15及PEG¹⁶)且具有高亲和力的抗体。此外，在治疗及诊断应用上，由微生物展示库(microbial display libraries)筛选出来的抗体不仅可能在结合亲和力方面不是最好的^1,2，还会缺少适当的糖化作用。再者，由于不可能对人体任意进行抗原免疫，因此得自人类患者的不死化B淋巴球，仅限于结合对抗该患者的致病抗原。因此，开发一个可在哺乳类细胞为主的表达系统中结合抗体基因的持续突变及糖化抗体的功能性表达的通用型抗体筛选系统，或可提供一种工具从小型抗体数据库(reportoire libraries)分离出高亲和力抗体，包括那些利用低免疫原性T细胞独立型半抗原(hapten)免疫后所得到的抗体数据库。

或者可通过给予低剂量抗体而引发剂量毒性低的类似疗效来增加亲和力较高的抗体的治疗系数。因此，目前已开发出许多可增强抗体结合亲和力的突变及工程策略，包括互补决定区(complementarity determining region，CDR)的突变^17-21、易错PCR(error-prone PCR)及DNA改组(DNA shuffling)^22-25。虽然这些方法通常会使亲和力变好⁹，但抗体基因的选殖及后续的亲和力成熟作用在技术仍相当困难、耗时又昂贵。进一步言之，噬菌体库可得到只和重链可变区结合、而不和轻链可变区结合的抗体²⁶。相对地，更自然的体细胞高频突变(somatic hypermutation，SHM)可促进那些很难用分子选殖及噬菌体库取得的新颖抗体生成^26,27。在此，我们发明了一种与生发中心(germinal center)B细胞当中所发生的的自然亲和力成熟作用十分类似的新颖抗体亲和力增强技术。

在哺乳类免疫系统中，骨髓中的前B细胞(pre-B cell)会经过重链及轻链基因的V-D-J重组，而生成主要的B-细胞受体(BCR，表面免疫球蛋白)库²⁸。使B细胞在生发中心中接触同源抗原(cognate antigen)，会引发胞苷的活化诱导胞苷去胺酶(AID)依赖性去胺反应，随后发生易错的DNA修复，这会在中心B母细胞(centroblast B cell)的免疫球蛋白(Ig)基因的V区引入点突变^29-32。在亲和力成熟作用期间筛选好的突变会生成能够制造高亲和力IgG、IgA及IgE抗体的B细胞³³。在分化后的浆细胞^34-36和融合瘤³⁷中，AID表达会降低。在融合瘤中，AID的人为过度表达可能会在内源性抗体基因的V区中诱导突变³⁸。