[发明专利]高产率制备生理活性多肽复合物的改进方法

权利要求书

1.一种胰岛素-非肽聚合物-免疫球蛋白恒定区复合物的制造方法，其包括如下步骤：

(1)使非肽聚合物与胰岛素或免疫球蛋白恒定区中的任一个进行反应的步骤；及

(2)在存在盐的条件下，使所述步骤(1)的反应混合物与胰岛素或免疫球蛋白恒定区中的另一个进行反应的步骤，

其中所述非肽聚合物其两端具有醛反应基，并且在步骤(2)中所述非肽聚合物的醛反应基键结到胰岛素及免疫球蛋白恒定区的N-末端胺基或Lys残基侧链的胺基；

所述非肽聚合物是聚乙二醇；

所述盐选自由氯化钠、乙酸钠、硫酸钠、磷酸钠和氯化钾所构成的群组；并且

所述盐按照0.3至3.0M的最终浓度添加。

2.根据权利要求1所述的制造方法，其中非肽聚合物通过所述两端的反应基而分别通过共价键与胰岛素及免疫球蛋白恒定区连接。

3.根据权利要求1所述的制造方法，其在所述步骤(1)后，还包括从反应混合物中分离胰岛素-非肽聚合物结合体或免疫球蛋白恒定区-非肽聚合物结合体的步骤。

4.根据权利要求1所述的制造方法，其中所述盐按照0.3至2.5M的最终浓度添加。

5.根据权利要求1所述的制造方法，其中在所述盐为氯化钠的情况下，按照低于3.0M的最终浓度添加，在为乙酸钠的情况下，按照低于2.5M的最终浓度添加，在为硫酸钠的情况下，按照低于0.7M的最终浓度添加，在为磷酸钠的情况下，按照低于0.8M的最终浓度添加，或在为氯化钾的情况下，按照1.0M以下的最终浓度添加。

6.根据权利要求1所述的制造方法，其中所述步骤(2)的反应时间为4至18小时。

7.根据权利要求1所述的制造方法，其中所述步骤(2)的反应温度为0至25℃。

8.根据权利要求1所述的制造方法，其中所述反应混合物进一步包含1至100mM的最终浓度的还原剂。

9.根据权利要求1所述的制造方法，其中步骤(1)是在pH值为5.0至6.5的条件下进行，步骤(2)是在pH值为6.0至8.5的条件下进行。

10.根据权利要求1所述的制造方法，其中在所述步骤(1)中，使非肽聚合物与胰岛素进行反应，在步骤(2)中，使步骤(1)的反应混合物与免疫球蛋白恒定区进行反应。

11.根据权利要求10所述的制造方法，其中所述步骤(1)使胰岛素与非肽聚合物按照1∶1至1∶20的摩尔比进行反应，

步骤(2)使步骤(1)的生成物与免疫球蛋白恒定区按照1∶0.5至1∶10的摩尔比进行反应。

12.根据权利要求11所述的制造方法，其中步骤(2)在盐为氯化钠的情况下，按照低于3.0M的最终浓度添加而进行，在盐为乙酸钠的情况下，按照低于2.5M的最终浓度添加而进行，在盐为硫酸钠的情况下，按照低于0.7M的最终浓度添加而进行，在盐为磷酸钠的情况下，按照低于0.8M的最终浓度添加而进行，或在盐为氯化钾的情况下，按照1.0M以下的最终浓度添加而进行。

13.根据权利要求1所述的制造方法，其中所述非肽聚合物的分子量范围是1至100kDa。

14.根据权利要求1所述的制造方法，其中所述免疫球蛋白恒定区被非糖基化。

15.根据权利要求1所述的制造方法，其中所述免疫球蛋白恒定区由选自由CH1、CH2、CH3及CH4区所构成的群组中的1个至4个区构成。

16.根据权利要求1所述的制造方法，其中所述免疫球蛋白恒定区进一步包含铰链区。