[发明专利]生产肉毒杆菌毒素的方法

权利要求书

1.一种生产肉毒杆菌毒素的方法，该方法包括以下步骤：

(a)用酸处理肉毒杆菌毒素生产株的培养物，以沉淀肉毒杆菌毒素；

(b)向沉淀的肉毒杆菌毒素中加入缓冲液，接着用蛋白酶抑制剂和核酸酶处理，从而提取肉毒杆菌毒素；

(c)用酸处理提取出的肉毒杆菌毒素以沉淀肉毒杆菌毒素并在缓冲液中溶解沉淀物；和

(d)通过阴离子交换色谱纯化肉毒杆菌毒素，

其中步骤(c)的酸沉淀是通过向提取出的肉毒杆菌毒素加入硫酸或盐酸，从而使提取出的肉毒杆菌毒素的pH值达到2.5-4.5来执行的。

2.根据权利要求1的方法，其中所述肉毒杆菌毒素生产株是肉毒梭菌。

3.根据权利要求1的方法，其中纯化的肉毒杆菌毒素是具有至少98％的纯度的A型肉毒毒素蛋白。

4.根据权利要求1的方法，其中步骤(a)的酸沉淀是通过向菌株的培养物中加入硫酸或盐酸，使培养物的pH值达到3.0-4.5来执行的。

5.根据权利要求1的方法，其中步骤(b)的蛋白酶抑制剂是苯甲脒HCl。

6.根据权利要求1的方法，其中步骤(b)的核酸酶是DNase和RNase。

7.根据权利要求1的方法，其中步骤(b)的肉毒杆菌毒素提取是在pH4.5-6.5进行的。

8.根据权利要求1的方法，其中步骤(c)的缓冲液是磷酸钠缓冲液。

9.根据权利要求1的方法，其中步骤(d)的阴离子交换色谱是在pH为3.5-7.5，和电导率为3-30mS/cm进行的。

10.根据权利要求1的方法，进一步在步骤(d)后包括步骤：

(e)用硫酸铵处理含有肉毒杆菌毒素的阴离子交换色谱级分，以形成沉淀物，并将沉淀物在缓冲液中溶解；和

(f)通过阴离子交换色谱纯化肉毒杆菌毒素。

11.根据权利要求10的方法，其中在步骤(e)中的硫酸铵是以10-50％的浓度(w/v)添加。

12.根据权利要求10的方法，其中在步骤(e)的缓冲液是磷酸钠缓冲液。

13.根据权利要求10的方法，其中在步骤(e)的阴离子交换色谱是在pH为3.5-7.5，和电导率为3-30mS/cm进行的。