[发明专利]生产肉毒杆菌毒素的方法

说明书

本发明涉及生产肉毒杆菌毒素的方法，更具体地涉及一种用于制备肉毒杆菌毒素的方法，该方法包括步骤：(a)用酸处理肉毒杆菌毒素生产株的培养物，以沉淀肉毒杆菌毒素；(b)向沉淀的肉毒杆菌毒素中加入缓冲液，接着用蛋白酶抑制剂和核酸酶处理，从而提取肉毒杆菌毒素；(c)用酸处理提取出的肉毒杆菌毒素以沉淀肉毒杆菌毒素并在缓冲液中溶解沉淀物；和(d)通过阴离子交换色谱纯化肉毒杆菌毒素。使用本发明的生产肉毒杆菌毒素的方法能够通过简单的过程生产出高纯度的肉毒杆菌毒素，这表明本发明的方法是非常经济有效的。相比于通过常规方法生产的肉毒杆菌毒素，通过本发明方法生产的肉毒杆菌毒素具有高纯度，并因此具有在局部作用增加的能力。因此，会导致副作用的肉毒杆菌毒素的体循减少，安全性增加。因此，本发明的肉毒杆菌毒素可用于各种目的，包括治疗神经肌肉障碍，去除皱纹，和治疗痉挛性偏瘫和脑瘫。

技术领域

本发明涉及生产肉毒杆菌毒素的方法，更具体地涉及一种用于制备肉毒杆菌毒素的方法，该方法包括步骤：(a)用酸处理肉毒杆菌毒素生产株的培养物，以沉淀肉毒杆菌毒素；(b)向沉淀的肉毒杆菌毒素中加入缓冲液，接着用蛋白酶抑制剂和核酸酶处理，从而提取肉毒杆菌毒素；(c)用酸处理提取出的肉毒杆菌毒素以沉淀肉毒杆菌毒素并在缓冲液中溶解沉淀物；和(d)通过阴离子交换色谱纯化肉毒杆菌毒素。

背景技术

自19世纪90年代已发现各种分泌神经毒素的梭菌属(Clostridium sp.)的菌株，并且在过去的70年已对从这些菌株分泌的毒素进行了表征(Schant,E.J.et al.,Microbiol.Rev.,56:80,1992)。

源自梭菌属菌株的神经毒素，即肉毒杆菌毒素，根据它们的血清学性质被分为七种类型(类型A至G)。每种毒素具有约150KDa大小的毒素蛋白并且天然含有几种非毒性蛋白的复合物。中等复合物(300kDa)由毒素蛋白和无毒的非血凝素蛋白组成，大复合物(450kDa)和非常大的复合物(900kDa)由结合到血凝素的中等复合物组成(Sugiyama,H.,Microbiol.Rev.,44:419,1980)。已知这种非毒性的血凝素蛋白是用于保护毒素免受肠道内的低pH值和各种蛋白酶的作用。

在细胞中，毒素被合成为具有约150kDa的分子量的单个多肽，然后通过胞内蛋白酶作用或用人造酶如胰蛋白酶处理，在从N-末端开始的1/3位置裂解成两个单位：轻链(L；分子量：50kDa)和重链(H；分子量：100kDa)。相比于单个多肽，裂解的毒素具有大大增加的毒性。两个单位通过二硫键彼此连接并具有不同的功能。重链结合至靶细胞的受体(Park.M.K.,et al.,FEMS Microbiol.Lett.,72:243,1990)并用于在低pH值(pH 4)与生物膜相互作用，以形成通道(Mantecucco,C.et al.,TIBS.,18:324,1993)，轻链具有药理活性，因此通过例如电穿孔导入细胞时，利用洗涤剂赋予细胞渗透性或干扰神经递质的分泌(Poulain,B.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,85:4090,1988)。

毒素在神经肌肉接头的胆碱能神经突触前处抑制乙酰胆碱的胞吐作用，造成乏力。已认为用非常少量的毒素进行处理展现毒性，这表明毒素具有任何酶活性(Simpson,L.L.et al.,Ann.Rev.Pharmaeol.Toxicol.,26:427,1986)。

根据最近的报道，毒素具有金属肽酶活性，并且其底物由小突触、突触融合蛋白、25KDa的突触相关蛋白(SNAP25)等组成，它们是胞吐机械复合物的单位蛋白。每种类型的毒素使用上述三种蛋白质之一作为底物，并且已知B、D、F和G型毒素在特定位点裂解小突触，A型和E型毒素在特定位点裂解SNAP25，和C型在特定位点裂解突触融合蛋白(Binz,T.etal.,J.Biol.Chem.,265:9153,1994)。

特别是，已知A型肉毒杆菌毒素可溶于pH为4.0-6.8的稀释水溶液。已知稳定的非毒性蛋白质在pH大约为7或更高时从神经毒素中分离，并且结果是，毒性逐渐丧失。特别是，已知毒性随pH和温度的增加而减少。