[发明专利]用于癌症靶向治疗的含有结合白蛋白的精氨酸脱亚胺酶的药物组合物

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2013年3月6日提交的美国临时专利申请系列号61/773,214和2014年3月5日提交的美国非临时专利申请系列号14/197,236的权利，其公开内容以引用方式全文并入于此。

技术领域

本发明描述了结合白蛋白的精氨酸脱亚胺酶(AAD)融合蛋白，其已经通过基因修饰形成具有高活性和长体内半衰期的物质。本发明进一步描述了用于制造不同ADD融合蛋白的DNA和蛋白质工程化设计。该AAD融合蛋白能够从粗蛋白的可溶性级分和不溶性级分(包涵体)中分离和纯化。本发明进一步涉及用于人和其他动物中的癌症靶向治疗和治愈精氨酸依赖性疾病的含结合白蛋白的精氨酸脱亚胺酶的药物组合物。

发明背景

胰脏癌、结肠癌、肝癌、黑素瘤和宫颈癌在全球人口中的发病率正在增加，迫切需要针对这些疾病的有效治疗方法。在许多类癌中，包括白血病、黑素瘤、胰腺癌、结肠癌、肾细胞癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、脑癌、宫颈癌和肝癌，癌细胞因缺乏精氨琥珀酸合成酶(ASS)的表达而成为精氨酸营养缺陷型，这使得这些癌症成为精氨酸消耗疗法极好的靶标。

精氨酸是人类以及其他哺乳动物的半必需氨基酸。它能够通过由尿素循环酶——精氨琥珀酸合成酶(ASS)和精氨琥珀酸裂解酶(ASL)——催化的两步反应由瓜氨酸合成。精氨酸能够被精氨酸酶代谢为鸟氨酸，鸟氨酸能够被线粒体中的鸟氨酸氨甲酰转移酶(OTC)转换为瓜氨酸。瓜氨酸可被再次利用合成精氨酸。由于精氨琥珀酸合成酶(ASS)和精氨琥珀酸裂解酶(ASL)丰富的催化活性，正常细胞通常不需要提供外源的精氨酸用于生长。相反，许多类癌不能表达ASS因此成为精氨酸营养缺陷型。他们的生长依赖于仅从血液循环中获得的精氨酸。因此，通过使用精氨酸降解酶靶向循环精氨酸是阻止ASS-阴性肿瘤增长的一种可行策略。[Feun et al.,Curr.Pharm.Des.14:1049-1057(2008)；Kuo et al.,Oncotarget.1:246-251(2010)]

精氨酸能够被精氨酸酶、精氨酸脱羧酶和精氨酸脱亚胺酶(ADI)降解。其中，精氨酸脱亚胺酶(ADI)似乎对精氨酸有着最高的亲和力(低K_m值)。ADI将精氨酸转化为瓜氨酸和尿素循环的代谢产物氨。不幸的是，ADI只存在于原核生物例如支原体(Mycoplasma sp.)中。从原核生物中分离和纯化ADI存在一些问题。从恶臭假单胞菌(Pseudomonas pudita)中分离的ADI不能在体内显示出有效，因为其在中性pH下酶活性低。从大肠杆菌(Escherichia coli)中生产的ADI是无酶活性的，随后需要多次变性和复性过程从而增加了随后的生产成本。

由于天然ADI是在微生物中发现的，因此它具有抗原性并且会从患者的循环中被迅速清除。ADI的天然形式在注射进入人体循环后具有免疫原性，且半衰期短(大约4小时)并能引起中和抗体[Ensor et al.,Cancer Res.62:5443-5450(2002)；Izzo et al.,J.Clin.Oncol.22:1815-1822(2004)]。这些缺陷可以通过聚乙二醇化修饰来纠正。在各种形式的聚乙二醇修饰ADI中，发现经由琥珀酰亚胺琥珀酸酯与聚乙二醇(分子量20,000)结合的ADI(ADI-PEG 20)是一种有效形式。然而，聚乙二醇化后ADI的活性显著降低了大约50％[Ensor et al.,Cancer Res.62:5443-5450(2002)]。以往制备经聚乙二醇修饰的ADI的尝试产生了非均一性的物质(这是由于PEG在蛋白质表面赖氨酸残基上的随机结合)，在生产过程中也很难对所述非均一性的物质表征和开展质量控制。此外，PEG非常昂贵，这极大地增加了生产成本。将经过聚乙二醇修饰的ADI静脉注射到体内后，观察到游离PEG的泄漏或分离，(没有PEG的)ADI则会引发免疫原性问题。因此，存在对改进的治疗癌症的组合物的需求，特别是具有增强的活性和延长的体内半衰期的改进的癌症治疗组合物。

发明内容