[发明专利]聚合酶链式反应检测系统

权利要求书

1.一种用于检测引物延伸产物的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供一个或多个寡核苷酸引物组，每组包含一个或多个寡核苷酸引物集，每个引物集的特征在于

i)第一寡核苷酸引物(正向引物)，其具有靶特异性部分和5'上游荧光盒特异性部分，以及

ii)第二寡核苷酸引物(反向引物)，其具有靶特异性部分，

其中特定引物集中的寡核苷酸引物分别适用于在相应靶核苷酸序列的互补链上的杂交以允许形成引物延伸产物，例如PCR产物，

并且其中同一组中的每个引物集的第一寡核苷酸引物含有荧光盒特异性部分，所述荧光盒特异性部分能够与同一组中任一引物集的第一寡核苷酸引物的荧光盒特异性部分的互补物进行杂交；

b)提供一个或多个盒寡核苷酸集，每集的特征在于

i)第一盒寡核苷酸，其用荧光部分(供体部分)标记，并且具有能够与给定寡核苷酸引物组中任一引物集的第一寡核苷酸引物的荧光盒特异性部分的互补物进行杂交的序列，以及

ii)第二盒寡核苷酸，其用受体部分(例如淬灭剂部分)标记，

其中每个盒寡核苷酸集互相杂交以形成荧光淬灭对，其中所述荧光淬灭对具有TmA；

c)起始引物延伸反应，从而产生与相关的第一寡核苷酸引物互补的序列(如果存在相关的靶多核苷酸)，

这样，相关的第二(受体，例如淬灭剂，被标记)盒寡核苷酸与相关的第一(荧光标记)盒寡核苷酸杂交的能力降低，藉以产生信号；以及

d)检测所产生的信号，

其中所述引物延伸反应至少部分在小于一个或多个荧光淬灭对的TmA的Ta进行。

2.权利要求1所述的方法，其中所述荧光淬灭对的Tm(TmA)比所述引物延伸反应的Ta高小于或等于15℃，任选地在1和15℃之间；或小于或等于10℃，任选地在1和10℃之间。

3.根据权利要求1或2的方法，其中所述方法防止或降低了非特异性扩增的检测。

4.根据前述任一项权利要求的方法，其中所述信号被实时测量。

5.根据权利要求1、2或3的任一项的方法，其中所述信号在所述反应的终点进行测量。

6.权利要求1-5任一项所述的方法，其中用荧光部分标记的所述或第一盒寡核苷酸能够作为引物延伸反应中的引物。

7.权利要求1-6任一项所述的方法，其中用荧光部分标记的所述或第一盒寡核苷酸不能作为所述引物延伸反应中的引物。

8.权利要求1-7任一项所述的方法，其中所述荧光(供体)标记的荧光盒寡核苷酸和所述受体(淬灭剂)标记的荧光盒寡核苷酸之间的相互作用的稳定性比所述荧光(供体)标记的荧光盒寡核苷酸和所述延伸产物之间的相互作用稳定，其中所述延伸产物与所述相关组的每个引物集的正向寡核苷酸引物的5'上游荧光盒特异性部分互补。

9.权利要求1-8任一项所述的方法，其中所述受体标记的寡核苷酸比相应的第一(荧光标记的)盒寡核苷酸短1至5个核苷酸碱基。

10.前述任一项权利要求所述的方法，其中每个寡核苷酸引物组包含一个寡核苷酸引物集。

11.前述任一项权利要求所述的方法，其中有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个寡核苷酸引物组和相应的盒寡核苷酸集。

12.前述任一项权利要求所述的方法，其中所述盒寡核苷酸之一或二者含有单个标记。

13.权利要求12所述的方法，其中所述盒寡核苷酸二者均含有单标记。

14.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述荧光标记的盒寡核苷酸在所述寡核苷酸的5'端处或者在所述寡核苷酸的5'端内含有标记。

15.根据前述任一项权利要求所述的方法或试剂盒，其中所述淬灭剂标记的盒寡核苷酸在所述寡核苷酸的3'端处或者在所述寡核苷酸的3'端内含有标记。

16.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中至少一个所述寡核苷酸，例如至少一个所述盒寡核苷酸，任选所述荧光标记的盒寡核苷酸中，至少一个碱基是硫代磷酸酯。

17.根据权利要求16所述的方法，其中至少一个所述寡核苷酸，例如至少一个所述盒寡核苷酸，任选所述荧光标记的盒寡核苷酸中，20-80％的碱基为硫代磷酸酯。