[发明专利]聚合酶链式反应检测系统

说明书

介绍

本发明涉及用于测定系统中的核酸检测的方法和试剂盒。

发明背景

聚合酶链式反应(PCR)是用于靶核酸序列的快速扩增的强有力的方法。PCR已经促进了基因表征(包括基因表达和/或调控)和分子克隆技术(包括PCR扩增的DNA的直接测序、等位变异的确定和感染性和遗传性疾病紊乱的检测)的发展。PCR是通过重复以下循环进行的：含有靶序列的DNA模板的热变性、相对引物与互补DNA链的退火和用DNA聚合酶对退火的引物进行延伸。多个PCR循环导致由侧翼扩增引物界定的核苷酸序列的扩增。向PCR操作步骤中引入热稳定性DNA聚合酶避免了重复添加酶的需要并允许退火和引物延伸温度的升高，其增强了引物:模板结合的特异性。因此，热稳定性聚合酶(诸如TaqDNA聚合酶)用于提高PCR的特异性和简便性。

在许多基于PCR的扩增中，采用了信号产生系统，例如来检测所扩增的产物的产生。在基于PCR的反应中使用的一类信号产生系统是荧光共振能量转移(FRET)系统，其中核酸探测器包括荧光供体和受体基团。FRET标记系统具有许多优于其他标记系统的优点，包括进行均相测定的能力，在该测定中不需要分离结合的和未结合的标记核酸探测物的步骤。许多现有技术的主要问题与双荧光标记的寡核苷酸的合成有关。欧洲专利申请EP1726664公开了一种检测系统，其通过使用不同熔融温度(Tm)的单标记的寡核苷酸序列来克服该问题，所述序列在自由溶液中互相杂交以形成荧光淬灭对(荧光团/淬灭剂盒)，一旦向所述序列之一引入互补序列则产生可测量的信号，所述序列之一具有低于所述PCR方法的退火温度(Ta)的Tm。在该系统中，所述单标记的寡核苷酸序列之一优选比其它的长超过10碱基并且更优选长至少15个碱基。

在使用标记的核酸探测物的检测系统中，高保真扩增是关键。由于PCR方法和TaqDNA聚合酶的性质，这样的方法可能遭受期望的聚合反应之外的替代性的副反应。例如，当该反应在室温进行时PCR可能遭受非特异性扩增。Taq聚合酶在所有温度下均保持其部分活性并因此能够延伸没有发生互补退火的引物，导致不期望的产物的形成。然后新合成的区域作为模板而进一步引物延伸和合成不期望的扩增产物。但是，如果在聚合开始之前将反应加热至大约50℃或更高的温度，则增加了引物退火的严格性，并且避免或减少了不期望的PCR产物的合成。

引物二聚体也是影响PCR的常见副反应。由于引物互相杂交并延伸，发生了引物二聚体的积累。引物二聚体的形成导致试剂耗尽并因此导致PCR效率的总体下降和/或假阳性结果的产生。

热启动PCR是减少非特异性扩增的方法并因此限制了包括引物二聚体的非特异性PCR产物的形成。已经开发了许多不同的方法来实现；参见例如Moretti,T.etal.EnhancementofPCRamplificationyieldandspecificityusingAmpliTaqGoldDNApolymerase.BioTechniques25,716–22(1998)和HotStartPCRwithheat-activatableprimers:anovelapproachforimprovedPCRperformanceNucleicAcidsRes(2008)36(20):e131。这样的方法减少了PCR开始之前非特异性杂交之后的引物延伸。但是，这样的技术仅部分解决了这样的问题，因为在PCR扩增期间仍然可能发生包括引物二聚体形成的错误引发(mis-priming)事件(尽管已经为更少的程度)。使用PCR探针检测PCR引物内部的序列的存在有助于阻止任何这样的非特异性产物的检测但给该过程增加了显著的费用，因为每个所要被检测的单独序列都需要专用探针。成本划算的高通量遗传分析需要使用通用检测系统但原则上这会被非特异性扩增产物的检测所影响。