[发明专利]RNA修饰的简易检测方法及用该检测方法的2型糖尿病的检查方法

说明书

本发明的目的在于提供用少量的RNA试样检测RNA中存在的修饰的方法。本发明的再一目的在于提供检测tRNA中存在的修饰，例如，硫甲基化的方法。本发明的另一目的在于提供通过检测tRNA的硫甲基化来诊断人2型糖尿病或者其风险的方法。本发明的特征在于，将RNA试样中的RNA所存在的修饰，用第1引物由RNA通过逆转录生成cDNA，将该cDNA的量与用第2引物由RNA通过逆转录生成的cDNA的量进行比较，从而检测RNA中存在的修饰(例如，硫甲基化)。

技术领域

本发明涉及使用逆转录法检测RNA修饰的方法。本发明还涉及将逆转录法与核酸扩增法，例如PCR法组合来检测RNA中的修饰并对修饰的程度进行定量的方法。更详细而言，本发明涉及使用包括与RNA的修饰部位的区域结合的引物和与不含有RNA的修饰部位的区域互补结合的引物的至少2种引物进行逆转录，接着进行核酸扩增，例如PCR，从而检测和/或定量该修饰的方法。本发明还涉及使用该检测方法的对2型糖尿病的遗传易感性的检查方法。

背景技术

转运RNA(tRNA)是解读mRNA的信息(密码子)并使对应的氨基酸转移至合成中的多肽链的接头分子，是在蛋白质翻译中具有中心作用的小分子RNA。tRNA的反密码子环受到化学修饰，而其对于翻译的忠实度(保真度)是必要的，尤其是位于反密码子的第34位碱基和紧邻反密码子的第37位碱基的化学修饰具有控制翻译的正确性的重要作用。此外，认为tRNA的反密码子环的化学修饰的破坏与疾病相关。

2型糖尿病是因环境因子和遗传因子的组合而发病的疾病，世界范围内患者超过2亿人，在许多国家中患者数量正在增加。2型糖尿病以胰岛素抗性和/或胰腺β细胞中的胰岛素分泌的异常作为特征，但是主要的机理尚在讨论中。2007年以后，在世界各国积极进行了以2型糖尿病患者作为对象的大规模基因多态性流行病学研究，确定了多个与糖尿病的患病具有相关性的基因单碱基多态性(SNP)。其中，在多篇论文中报告了Cdkal1(cdk5regulatory associated protein 1-like 1)的SNPs与2型糖尿病的发病具有最高的相关性。而且，已明确对于拥有Cdkal1基因的风险等位基因(Risk allele)的人而言，葡萄糖响应性胰岛素分泌差，但与肥胖、胰岛素抗性不相关。另外，亚洲人种大多拥有该基因风险等位基因，考虑到风险等位基因拥有者的表现型，推测Cdkal1的SNPs与亚洲人种2型糖尿病的发病相关。

而且，已明确Cdkal1的生理功能是将与赖氨酸对应的tRNA的第37位的腺嘌呤硫甲基化而制成2-甲硫基-N⁶-苏氨酰基氨甲酰基腺苷(ms²t⁶A)的酶(非专利文献1：ArragainS.,et al.J.Biol.Chem.285,28425-28433(2010)和非专利文献2：富泽等，上原记念生命科学财团研究报告书，25(2011)论文编号77)。显示出ms²t⁶A修饰对于赖氨酸密码子的正确解码(decoding)是必要的(非专利文献1)，在防止同源密码子(cognate codons)的错读方面，尤其是在翻译速度比较快时在防止错读方面发挥重要的作用(非专利文献3：富泽等，Endocrine Journal 2011,58(10),819-825)。

报告了如下内容：对于Cdkal1缺失小鼠，观察到线粒体ATP生成和第一相胰岛素分泌被损害，而且，胰腺β细胞特异性Cdkal1敲除小鼠显示2型糖尿病的疾病状态，被观察到胰岛肥大和血中葡萄糖的控制障碍，对由高脂肪食物诱发的内质网应激是过敏的(非专利文献3和非专利文献4：Wei,F.Y.et al.J.Clin.Invest.121,3598-3608(2011))。