[发明专利]信使RNA加帽效率的定量评估

权利要求书

1.一种定量mRNA加帽效率的方法，所述方法包括：

(1)提供包含加帽mRNA和未加帽mRNA的mRNA样品；

(2)在允许与邻近加帽或未加帽的mRNA的倒数第二个碱基的所述mRNA的5'未翻译区中的序列互补的DNA寡核苷酸与所述序列复性的条件下使所述mRNA样品与所述DNA寡核苷酸接触；

(3)提供选择性降解DNA/RNA杂合体和/或未复性mRNA的一种或多种核酸酶，得到加帽片段和未加帽片段；

(4)通过色谱分离所述加帽片段和未加帽片段；和

(5)测定所述加帽片段和未加帽片段的相对量，从而定量mRNA加帽效率。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述帽具有式I结构：

其中，

B是核碱基；

R₁选自卤素、OH和OCH₃；

R₂选自H、OH和OCH₃；

R₃是CH₃、CH₂CH₃、CH₂CH₂CH₃或不存在；

R₄是NH₂；

R₅选自OH、OCH₃和卤素；

n是1、2或3；并且

M是所述mRNA的核苷酸。

3.如权利要求2所述的方法，其中所述核碱基是鸟嘌呤。

4.如前述权利要求任一项所述的方法，其中所述帽是具有式II结构的m⁷G帽或具有式III结构的未甲基化帽：

其中，

R₂是H或CH₃；

R₄是NH₂；

R₅是OH或OCH₃；

R₆是H或CH₃；并且

M是所述mRNA的核苷酸；或

其中M是所述mRNA的核苷酸。

5.如权利要求1-4任一项所述的方法，其中步骤(4)进一步分离甲基化加帽RNA和未甲基化加帽RNA。

6.如权利要求5所述的方法，其中甲基化帽包括在R₃和/或R₅位置的甲基化。

7.如权利要求5或6所述的方法，其中所述方法还包括定量测定所述加帽RNA的甲基化百分比的步骤。

8.如权利要求1-7任一项所述的方法，其中所述DNA寡核苷酸长度为10-80个核苷酸。

9.如权利要求1-8任一项所述的方法，其中所述DNA寡核苷酸两侧都具有一个或多个RNA核苷酸。

10.如权利要求1-9任一项所述的方法，其中所述mRNA的5'未翻译区中的序列在从加帽或未加帽的mRNA倒数第二个碱基的1或2个碱基内。

11.如权利要求1-10任一项所述的方法，其中所述一种或多种核酸酶包括RNA酶H。

12.如权利要求1-11任一项所述的方法，其中所述一种或多种核酸酶包括产生平端加帽片段和未加帽片段的核酸酶。

13.如权利要求12所述的方法，其中所述核酸酶是核酸酶S1、RNA酶H、或另一种5'核酸外切酶。

14.如权利要求1-13任一项所述的方法，其中所述加帽片段和未加帽片段包括所述mRNA的不超过5个碱基。

15.如权利要求1-13任一项所述的方法，其中所述加帽片段和未加帽片段包括所述mRNA的不超过2个碱基。

16.如权利要求1-15任一项所述的方法，其中步骤(4)包括将所述加帽片段和未加帽片段施加至色谱柱的步骤。