[发明专利]信使RNA加帽效率的定量评估

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2013年3月14日提交的美国临时专利申请序号61/784,337的优先权，其公开内容通过引用整体并入本文。

背景

信使RNA(“mRNA”)疗法正成为用于治疗多种疾病的日益重要的方法。有效的mRNA疗法需要将mRNA有效递送至患者以及在患者体内有效生成由该mRNA编码的蛋白。为了优化mRNA递送和体内蛋白生成，通常在构建体的5'端需要适当的帽，其防止mRNA降解并促进成功的蛋白翻译。因此，加帽效率的准确表征对于确定mRNA治疗应用的质量是特别重要的。

发明概述

本发明提供了用于准确且定量测定mRNA加帽效率的改良方法，特别是体外合成的mRNA。如上讨论的，适当的加帽对于成功的体内蛋白生成是重要的。然而，在本发明之前，大多数帽测定是定性的，这不足以评估基于mRNA的治疗产品质量和相关的体内使用安全性和效力。事实上，在本发明之前，还没有可用的允许在不永久改变样品中mRNA的条件下定量加帽效率的方法。

如下详细描述的，本发明部分基于通过色谱产生和定量加帽片段和未加帽片段。因此，本发明提供了用于评估mRNA加帽效率的简单、可靠且有效的定量方法。本发明特别用于mRNA生产期间的质量控制以及mRNA作为最终治疗产品中活性药物成分(API)的表征。

一方面，本发明提供了定量mRNA加帽效率的方法，包括以下步骤：(1)提供包含加帽mRNA和未加帽mRNA的mRNA样品；(2)在允许与邻近加帽或未加帽的mRNA的倒数第二个碱基的所述mRNA的5'未翻译区中的序列互补的DNA寡核苷酸与所述序列复性的条件下使所述mRNA样品与所述DNA寡核苷酸接触；(3)提供选择性降解DNA/RNA杂合体和/或未复性mRNA的一种或多种核酸酶，得到加帽片段和未加帽片段；(4)通过色谱分离所述加帽片段和未加帽片段；和(5)测定所述加帽片段和未加帽片段的相对量，从而定量mRNA加帽效率。

在一些实施方案中，本发明的发明方法可用于定量具有式I结构的帽：

其中,

B是核碱基；

R₁选自卤素、OH和OCH₃；

R₂选自H、OH和OCH₃；

R₃是CH₃、CH₂CH₃、CH₂CH₂CH₃或不存在；

R₄是NH₂；

R₅选自OH、OCH₃和卤素；

n是1、2或3；并且

M是该mRNA的核苷酸。

在一些实施方案中，该核碱基是鸟嘌呤。

在一些实施方案中，本发明的发明方法可用于定量具有式II结构的m⁷G帽或具有式III结构的未甲基化帽：

其中，

R₂是H或CH₃；

R₄是NH₂；

R₅是OH或OCH₃；

R₆是H或CH₃；并且

M是该mRNA的核苷酸。

其中M是所述mRNA的核苷酸。

在一些实施方案中，步骤(4)进一步分离甲基化加帽RNA和未甲基化加帽RNA。在一些实施方案中，甲基化的帽包括在如式I所示R₃和/或R₅位置的甲基化。在一些实施方案中，根据本发明的发明方法还包括定量测定所述加帽RNA的甲基化百分比的步骤。