[发明专利]具有贮存稳定性、用于快速浇制、印迹和成像的聚丙烯酰胺凝胶

说明书

相关申请的交叉参考

本申请要求2013年3月15日提交的美国临时专利申请号61/793,884的优先权，该文通过引用纳入本文。

发明背景

聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)广泛用于生物技术实验室，用于处理生物样品，以分离该样品中存在的生物分子以供于鉴定，并且在一些情况中，用于定量分离的物质。蛋白质混合物、肽混合物，以及DNA、RNA和DNA与RNA的片段的混合物都可在聚丙烯酰胺凝胶上分离。对于蛋白质混合物，PAGE的具体应用形式是SDS-PAGE，其中在样品中含有十二烷基硫酸钠(SDS)。所有蛋白质均由相连的氨基酸残基组成，并且各蛋白质自然折叠成三维形状，这是每个个体蛋白质的特征和特点。因此，氨基酸序列和折叠的蛋白质的形状在蛋白质之间彼此不同。然而，在SDS的存在下，蛋白质经历变性，即，它们会展开，进而失去其特征三维形状。因此，所有变性的蛋白质具有相同的形状，并且能在SDS-PAGE中仅依赖于其分子量而被分离。由于蛋白质在氨基酸的数量和种类上均有差异，不同的蛋白质通常具有不同的分子量，并且常见蛋白质的分子量范围较大。

然而，某些蛋白质的分子量极为接近，这使其难以在SDS-PAGE中分离。为了分离所述蛋白质，或使它们的分离最优化，通常在不连续的凝胶，即，由在“分离(resolving)”(还称作“分离(separating)”)凝胶之上浇制的“积层(stacking)”或“积层(stacker)”凝胶组成的组合凝胶中进行SDS-PAGE，其中所述积层凝胶具有较低的聚丙烯酰胺浓度，进而具有较高的多孔性。积层凝胶和分离凝胶在某一界面接触，在该界面处发生多孔性的梯式(stepwise)变化，并且在某些情况中，该界面处还包含pH从积层凝胶中的约中性或略酸性(pH 6.6～7.0)到分离凝胶中的碱性(pH 8.6～9.0)的梯式变化。与这些不连续构成无关，溶质、缓冲溶液和和电流能够自由穿过该界面，从所述凝胶的一部分到另一部分。该组合凝胶以垂直位置取向，其中积层凝胶处于分离凝胶上方，而样品初始时被置于积层凝胶的顶部边缘。然后施加合适极化的电场，以使样品中的蛋白质穿过积层凝胶朝向所述界面向下迁移，并进入分离凝胶。在迁移的初始阶段，蛋白质在所述界面处汇集在单一明晰条带中。然后，所述蛋白质继续其迁移，并进入分离凝胶，此时所述单一条带分离成代表个体蛋白质的多个条带。丙烯酰胺在分离凝胶中的百分比可变化，以实现蛋白质的最优分离。然而，一般而言，较大蛋白质在具有相对较低的百分比的分离凝胶中最易分离，而较小蛋白质在具有高百分比的分离凝胶中最易分离。

可是，凝胶的浇制是耗时且耗力的过程，因而，研究者购买预形成凝胶而不是在使用前浇制凝胶的现象变得越发普遍。购得的凝胶通常称为“预浇制凝胶”，而实验室中制备的那些称为“手工浇制凝胶”。预浇制凝胶的生产商已开发出在多个方面优于手工浇制凝胶的凝胶。例如，在贮存数天后，聚丙烯酰胺凝胶中的分辨力趋于下降，因此，通常在即将使用前不久制备手工浇制凝胶。生产商们通过配制预浇制凝胶而解决了该问题，将预浇制凝胶的寿命延长至一年或更久。另一个难点关于凝胶跑动时的电场强度，以及完成跑动所需的时间长度。手工浇制凝胶通常在低电场强度下跑动，以避免凝胶在跑动过程中升温，因为升温会造成实验中的失真，但是电场强度越低，实现蛋白质分离所需的时间越长。生产商们已解决了该问题，通过配制能够承受高场强度而不显示因升温所致的异常现象的预浇制凝胶。能够解决这些问题的凝胶制剂的公开内容可见于：Rowell等，美国专利号US 8,282,800 B2(2012年10月9日)，和Petersen等，美国授权前申请号US 2010/0187114 A1(2012年7月29日)。