[发明专利]三螺旋蛋白的纯化

权利要求书

1.一种用于纯化其中三螺旋蛋白分泌至培养基中的在非哺乳动物宿主细胞培养提取物或通过宿主细胞破裂以释放宿主细胞保留的蛋白而制备的宿主细胞培养匀浆物内含有的重组表达三螺旋蛋白的方法，所述方法包括：

(i)在pH小于7的酸性条件下和在低于所述三螺旋蛋白的熔化温度的温度下从三螺旋蛋白中沉淀出存在于所述宿主细胞培养提取物或匀浆物中的宿主细胞物质；接着

(ii)通过添加在所述酸性条件下有功能的蛋白酶来消化沉淀后的宿主细胞培养提取物或匀浆物中的残余的可溶性宿主细胞物质，其中所述三螺旋蛋白对消化具有抗性；以及

(iii)收集所述经纯化的三螺旋蛋白；

其中所述三螺旋蛋白是胶原蛋白或胶原蛋白状蛋白；其中所述三螺旋蛋白在至少步骤(i)和(ii)中均保持可溶；并且其中所述三螺旋蛋白包含重复(Gly-X-Y)n基序，其中n在5与600之间，并且X和Y独立地为任何天然或非天然亚氨基或氨基酸。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述三螺旋蛋白在步骤(i)至(iii)中均保持可溶。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述消化使用酸性蛋白酶来进行。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述蛋白酶选自由以下组成的组：胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶、奇异果蛋白酶、佐氏曲霉酸性蛋白酶、胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述酸性条件是指pH值小于7。

6.根据权利要求1所述的方法，还包括通过将培养提取物或匀浆物的pH值调节至中性pH值来终止消化。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述宿主细胞为细菌、酵母或植物宿主细胞。

8.根据权利要求1所述的方法，其在所述沉淀步骤与所述消化步骤之间还包括额外的中间分离步骤，所述分离步骤以物理方式从经沉淀的宿主细胞物质分离所述三螺旋蛋白。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述额外的中间分离步骤选自离心、过滤、交叉流过滤或沉降中的一种或多种。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述表达的三螺旋蛋白在所述宿主细胞内以细胞内方式产生。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述表达的三螺旋蛋白是从所述宿主细胞分泌的。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法在低于所述三螺旋蛋白的熔化温度(Tm)的温度下进行。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述温度比所述三螺旋蛋白的Tm低至少10℃。

14.根据权利要求5所述的方法，其中所述pH值在2与4之间并且所述宿主细胞为细菌宿主细胞。

15.根据权利要求5所述的方法，其中所述pH值在4与6之间并且所述宿主细胞为酵母宿主细胞。

16.根据权利要求5所述的方法，其中所述pH值在2与4.5之间并且所述宿主细胞为植物宿主细胞。

17.根据权利要求3所述的方法，其中所述方法相比于对蛋白水解不稳定的蛋白质，选择性地纯化对蛋白水解稳定的三螺旋蛋白质。

18.根据权利要求1所述的方法，其中从所述收集的三螺旋蛋白移除宿主细胞核酸。

19.根据权利要求1所述的方法，其中所述收集还包括通过渗滤或沉淀浓缩所述三螺旋蛋白。