[发明专利]三螺旋蛋白的纯化

说明书

本发明涉及一种用于纯化从细菌、酵母或植物宿主细胞重组产生的三螺旋或胶原蛋白状蛋白质的方法。

其他申请的交叉参考

本文所引用的所有公开案、专利、专利申请和其他参考均以全文引用的方式并入，如同表明每个个别公开案、专利、专利申请或其他参考具体且单独地以引用的方式并入一般。

本申请要求2013年3月21日申请、标题为“Purification of triple helicalproteins”的澳大利亚专利申请号2013900990的优先权。此申请的全部内容以引用的方式并入本文。

序列表

本申请与电子形式的序列表一起提交。序列表的全部内容以引用的方式并入本文。

公开领域

本发明涉及一种用于纯化从细菌、酵母或植物宿主细胞重组产生的三螺旋或胶原蛋白状蛋白质的方法。

背景

胶原蛋白是动物的细胞外基质中的主要结构蛋白，且定义为需要(Gly-Xaa-Yaa)_n重复序列的特征性三螺旋结构。在Xaa和Yaa位置中发现的氨基酸常为脯氨酸，其中Yaa位置中的Pro经翻译后修饰为羟脯氨酸(Hyp)，所述羟脯氨酸提升三螺旋稳定性。在人类中，存在至少28种胶原蛋白类型的家族，各自具有类型特异性生物学功能和结构功能。三螺旋基序也存在于其他蛋白质中，诸如巨噬细胞清道夫受体、胶原凝集素和C1q。

最丰富的胶原蛋白为间质、原纤维形成胶原蛋白，尤其是I型胶原蛋白。这些胶原蛋白经由形成通过特异性交联稳定的纤维束网状物来在动物中形成主要组织结构，以使组织具有稳定性和强度。与‘大’原纤维形成胶原蛋白(I型、II型和III型)相反，‘小’胶原蛋白分布一般较不广泛，且通常发现于其中小胶原蛋白可为重要和关键成分的特定组织位置中；例如肥大软骨中的X型胶原蛋白或基底膜中的IV型胶原蛋白。

已显示胶原蛋白在各种临床应用中的多种医学产品中安全且有效(Ramshaw等人，J Materials Science,Materials in Science,(2009)，20(1)第3-8页)。对医学应用而言，胶原蛋白一般以两种明显相异的形式使用。在一种形式中，在化学稳定化之后使用完整组织，诸如在主动脉瓣膜替换中使用戊二醛固定的猪心瓣膜。另一种形式为经由制备经纯化的可溶性胶原蛋白(诸如适用于伤口涂剂的无水稳定化薄片或挤压纤维、用于半月板修复的粘附屏障或装置)，所述可溶性胶原蛋白复原为各种产品且加工得到产品的所需形状或形式。必要时，胶原蛋白装置可通过化学固定(例如戊二醛)或通过物理方法(例如干热交联)而稳定化。经纯化的可溶性胶原蛋白也广泛用作用于软组织加强以及还用于治疗尿失禁的胶原蛋白浆。复原产品的特征在于较高生物化学纯度，所述较高生物化学纯度与组织中的生物学功能中至关重要的低免疫原性、受控转换(常经较短时间段)、受控孔隙度和细胞-基质相互作用的滞留相关。

为纯化来自动物胶原组织的胶原蛋白，典型方法包括经由使用酶消化步骤以移除交联区而保留三螺旋完整，来使组织初始消化和溶解。溶解的胶原蛋白可随后经纯化以移除潜在免疫原性污染物。例如，US6548077描述来自组织的胶原蛋白的制备，其涉及使胶原蛋白与第一蛋白水解酶接触，接着与还原剂和第二蛋白水解酶接触。

Addad等人(Mar.Drugs(2011),9(6),967-983)描述使用组织提取物的酸性胃蛋白酶溶解作用来纯化来自水母的胶原蛋白。然而，为获得稳定和适用的最终产物，需要交联步骤。用酸且具体地用乙酸处理导致组织膨胀，并且在胃蛋白酶消化之后得到可溶性胶原蛋白。所得可溶性胶原蛋白产物将是可能需要复原为不溶形式以用于许多医学应用的弱的非纤维材料。

已公开的替代性方法包括将富含胶原蛋白的天然动物组织研磨成极精细粒子，所述粒子可在加工成适用的医学材料之前或之后经洗涤为无杂质。