[发明专利]通过单分子操作来检测DNA修饰和蛋白结合的方法

权利要求书

1.一种用于确定蛋白与含有核酸序列的核酸分子结合的方法，所述方法包括步骤：

a)通过向含有核酸序列的双链核酸分子施加物理力，使所述分子变性；

b)提供所述蛋白；

c)在所述蛋白存在时使所述双链核酸分子复性；

d)检测双链核酸复性的阻断；以及

e)确定所述阻断在所述双链核酸分子上的位置。

2.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤b)中进一步提供与所述序列对应的单链核酸分子。

3.根据权利要求1或2中任一项所述的方法，其中所述双链核酸分子是发夹。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中双链核酸的链之一的至少一个碱基直接或间接地附着到表面，并且其中双链核酸另一条链的至少一个碱基附着到可移动的表面。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中在步骤a)中通过移开支持物使双链核酸变性。

6.根据权利要求5所述的方法，其中通过移开支持物将物理力施加至双链分子，所述物理力高于或等于15pN，优选高于或等于17pN，更优选高于或等于18pN。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中在步骤c)中通过将支持物带至一起而使变性的双链核酸复性。

8.根据权利要求7所述的方法，其中通过将支持物带至一起使施加至双链分子的力降低到少于或等于12pN，优选少于或等于11pN，更优选少于或等于10pN。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中双链核酸未附着至支持物的端与另一端共价或非共价相连。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中步骤a)至d)重复几次(以便积累测量和增加信号/噪音比)。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中步骤d)的检测包括测量双链核酸分子附着至支持物的两端之间的距离(z)。

12.根据权利要求11所述的方法，其包括另一步骤，当双链核酸分子变性时，测量所述双链核酸分子附着至支持物的两端之间的距离(z_高)。

13.根据权利要求12所述的方法，其中步骤e)还包括比较z和z_高的在先步骤。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其包括测量阻断的持续时间的另一步骤。

15.根据权利要求14所述的方法，其包括将阻断的持续时间与参考值相比较的另一步骤。

16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其还包括测序所述蛋白结合的核酸序列的步骤。

17.一种用于鉴定含有能够结合特异性核酸-结合蛋白的序列的核酸分子的方法，所述方法包括步骤：

a)提供双链核酸分子的群体；

b)通过权利要求1至16中任一项所述的方法，测试所述蛋白与所述核酸分子的结合；以及

c)选择能够结合所述蛋白的核酸分子。

18.一种用于检测双链核酸分子内所包含的至少一个修饰碱基的方法，所述方法包括步骤：

a)提供所述双链核酸；

b)提供能够结合所述修饰碱基的蛋白；以及

c)通过权利要求1至16中任一项所述的方法，测试所述蛋白与所述核酸分子的结合。

19.根据权利要求18所述的方法，其中修饰碱基选自4-甲基胞嘧啶(4mC)、5-甲基胞嘧啶(5mC)、5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)、5-甲酰胞嘧啶(5fC)、5-羰基胞嘧啶(5caC)、5-羟甲基尿嘧啶(5hmU)和N6-甲基腺苷(m6A)。

20.根据权利要求18或19中任一项所述的方法，其中修饰碱基是5mC。

21.根据权利要求18至20中任一项所述的方法，其中所述蛋白是能够结合所述修饰碱基的抗体。