[发明专利]通过单分子操作来检测DNA修饰和蛋白结合的方法

说明书

技术领域

本发明涉及用于确定蛋白是否结合特异性DNA序列的方法。这种方法特别用于通过特异性识别这些修饰的蛋白(例如，抗体)的结合来鉴定DNA序列的修饰(例如，甲基化)，也用于鉴定各种蛋白在DNA上的结合序列。

背景技术

蛋白与DNA的结合是在生物学中的重要现象；它在调节细胞和病毒功能中具有基本作用。这些包括基本细胞过程，如DNA复制、转录、DNA修复和DNA重组、还有DNA修饰或染色体结构的维护。

有几种蛋白结合到基因组中特定位点来调节基因组的表达和维持。DNA-结合蛋白组成具有多样化和重要生物学功能的蛋白大家族。DNA-结合蛋白家族是细菌、古生菌和真核生物的各种基因组中最受关注和研究最多的之一。大多数这些蛋白(如真核和原核转录因子)含有独立的折叠单元(结构域)以实现其与DNA轮廓的识别。它们包括重要的基因调节蛋白(称为转录因子及DNA加工蛋白)，如例如DNA和RNA聚合酶、DNA连接酶、DNA解旋酶、DNA内切酶和外切酶、以及DNA修复和重组蛋白。

已证明鉴定这些蛋白结合位点是艰巨的任务。例如，在人类基因组中，有多于700个预测的C₂H₂锌指转录因子(Tadepally等人,BMCEvol.Biol.,8:176,2008)，但这些中只有约10％具有已知结合基序(Matys等人,NucleicAcidsRes.,34:D108-D110,2006)。此外，虽然蛋白结合DNA的热力学平衡性质是公知的，然而测定其结合和解结合的动力学是更具挑战性的问题。

使用各种方法，如凝胶移位分析、足迹、和转录激活来研究DNA-蛋白相互作用(Carey等人,ColdSpringHarbProtoc,2012(7):733-57,2012)。虽然每种这些方法可提供关于结合的位置或影响的不同信息，它们却不能提供定量测量特异性结合的简单方法。荧光偏振/各向异性提供了快速、非放射性方法以直接在溶液中不使用过滤器结合、电泳、或沉淀步骤就能精确测量DNA-蛋白结合(Guest等人,1991；Heyduk和Lee,1990；LeTilly和Royer,1993；Lundblad等人,1996；Royer等人,1992)。

基因组信息指导不同生物分子合成的分子机制一直是过去三十年很多分子生物学研究的重点。以前的研究通常集中在单个基因，使用所得到的一般原理然后为以下提供见解：转录、染色质重塑、信使RNA剪接、DNA复制和许多其它基因组加工。尽管在研究其它基因时很多这样原理似乎有效，然而这些原理通常没有提供关于基因组范围对生物功能的见解。另一方面，转录和调节信息的系统分析对鉴定基因和调节区是必需的，并且是人类生物学和疾病研究中的重要的资源。这种分析还可以提供对细胞环境、物种和个体中组织和基因变异性(variability)以及调节信息的综合观点。

全基因组的努力，例如编码项目(Encodeproject)(DNA元件的百科全书(EncyclopediaofDNAElements))，来鉴定例如在人类基因组中的所有转录因子结合位点，这已被证明很麻烦并且是非常劳动密集型的(TheENCODEProjectConsortium,Nature,489:57-74,2012)。

因此，仍然需要检测蛋白/核酸相互作用的简单而可靠的方法。

发明内容

本发明涉及通过物理操作用于确定蛋白与核酸分子结合的方法。

根据本发明的基于物理技术和电子处理的方法，不同于目前化学或生物化学的方法。其比现有技术提供很多优点：

1)其是高度灵敏的，因为它是基于检测单蛋白或蛋白复合物分子与单核酸分子。使用单分子不仅能够提供测量蛋白寻找其核酸靶所需时间以及蛋白停留在其靶上时间，还能够精确定位结合事件。

2)不使用昂贵的(具有荧光团或一些其它基团)标记的核苷酸。

3)通过测量双链核酸分子两端之间的距离，使得它能够确定蛋白结合位点沿着所述双链核酸上的精确定位(以bp计)。

4)可在第二时标(time-scale)中周期性重复测量，从而导致消除假阳性、改进统计并显著降低仪器漂移(drift)。

5)实验可以在同一分子上重复多次，从而改进统计和测量的可靠性。

6)它能够检测任何核酸结合蛋白。因此，可鉴定特异性识别核酸的结构修饰的蛋白，从而检测结构修饰的位点。

本发明涉及基于蛋白在测序的核酸分子上的结合位点的物理定位来检测蛋白与核酸序列的结合的方法。