[发明专利]用于增加蛋白质的焦谷氨酸形成的方法

说明书

技术领域

本发明涉及用于在纯化过程内将蛋白质的N-端谷酰胺和/或谷氨酸残基转化成焦谷氨酸的方法。此外，本发明还涉及用于纯化含有N-端焦谷氨酸的蛋白质的方法。本发明的方法可以包括在用于制备具有N-端焦谷氨酸的蛋白质，具体来说用于制备用于药学产物的活性药学成分(API)的制造过程中。

背景技术

大部分重组型治疗蛋白质显示一种或多种转译后修饰。这些修饰可在其核糖体合成期间或(更通常)在合成完成之后出现。迄今已表征许多转译后修饰，并且这些修饰可赋予所影响的蛋白质一些结构方面或功能性作用。与治疗蛋白质相关联的常见转译后修饰包括羧基化和羟基化、酰胺化和硫酸化、双硫键形成和蛋白水解处理，以及糖基化、异构化、氧化、环化(N-端谷酰胺或谷氨酸转化成焦谷氨酸)、片段化和聚集作用。因此，转译后修饰可由蛋白质的酶促修饰或由非酶促转化引起，并且转译后修饰可在细胞培养期间或在蛋白质的纯化或储存期间在表达宿主内部出现。

重组型单克隆抗体对生物技术行业具有巨大价值并且许多抗体已批准用于治疗多种疾病。由于抗体通常在哺乳动物细胞(如CHO细胞)中产生，其可具有许多不同的转译后修饰，从而引起产物的不均匀性。不均匀性可由抗体的表面电荷的变化引起，由带电残基的数目的变化直接引起，或由改变表面电荷分布的化学或生理变化(如糖基化、重链的C-端赖氨酸的羧基肽酶截割和N-端谷酰胺或谷氨酸残基环化成焦谷氨酸)间接引起。

抗体典型地由基本结构单元组成，每个基本结构单元具有通过二硫桥键和非共价相互作用接合的两个大型重链和两个小型轻链。存在若干不同类型的抗体重链和若干不同类型的抗体，该等抗体基于其所具有之重链而分组成不同的同型。举例来说，视重链恒定区的基因而定，存在四种人类IgG的同型(1到4)。轻链恒定结构域由两种基因(κ或λ)编码。因此，每个IgG同型可以是κ或λ，例如IgG1κ。尽管不同类型的细胞系中产生若干类型的抗体，但最有临床价值的抗体是IgG1或IgG2型全长抗体。

许多人类IgG1或IgG2型抗体在轻链或重链或其两者的N-端含有谷氨酸(Glu)和/或谷酰胺(Gln)残基。大部分轻链基因编码谷氨酸或谷酰胺。这类N-端谷氨酸和/或谷酰胺残基可经历环化以形成焦谷氨酸(pGlu)，如图1所示。因此，焦谷氨酸形成在几乎所有的有临床价值的抗体中发生并且过程的不同完整性程度成为不均匀性的常见原因。这种不均匀性在治疗抗体中不符合需要，因为这些变化可通过改变带电基团的数目直接地或通过引入结构变化间接地改变抗体的表面电荷特性。这类修饰具有降低生物活性以及改变药物动力学和抗原性的潜力。

在谷酰胺的环化期间，N-端伯胺(在中性pH值下带正电)转化成中性酰胺，引起抗体的净电荷变化。所述反应伴随有氨损失(17Da)。因此，环化不足可由阳离子交换色谱检测为碱性变异体，因为主峰通常是完全环化的物质，或由反相HPLC检测为较晚洗脱的峰，因为在N-端胺损失之后疏水性增加。

谷氨酸的环化通过侧链的羧基和N-端胺发生，因此形成中性酰胺并且释放水(18Da)。净电荷保持相同，因为一个酸性基团和一个碱性基团在反应中缩合，然而，损失两个带电残基可增加分子的疏水性，使得可通过反相HPLC检测。

尚未完全理解抗体中的焦谷氨酸形成机制。环化可自发地发生或其可由酶谷酰胺酰基环化酶辅助。仍然不清楚谷酰胺酰基环化酶在最通常用于抗体制备的CHO细胞系中是否是活性；然而，自发环化的比率表明反应可能是非酶促型的。

举例来说，Yu等人(药学和生物医学分析杂志(JournalofPharmaceuticalandBiomedicalAnalysis)2006；42:455-463)历时3个月的时间段研究单克隆抗体的轻链和重链的N-端处由谷氨酸(Glu或E)进行的非酶促焦谷氨酸形成。Yu等人陈述，视过程发展期间的pH值和温度条件而定，mAb的Glu到pGlu的这一非酶促环化可能是mAb制备和储存中发生的主要分解途径中的一种。其得出尚不清楚这类焦谷氨酸是否可引起其它修饰和改变mAb生物活性或治疗效能的结论，并且其提出密切监测N-端pGlu形成，因为其对于确保具有N-端Glu的mAb疗法的品质来说是重要的。