[发明专利]经由去糖基化步骤对蛋白质的改良纯化

权利要求书

1.一种用于从包含目的多肽的水性介质中纯化此类目的多肽的方法，其中所述方法包括以下步骤：

(i):获得由包括糖基化形式的所述目的多肽的许多组分组成的水性样品；其特征在于

(ii):将糖苷酶和/或化学处理(例如用高碘酸盐处理)添加到步骤(i)的样品中，以便使所述目的多肽去糖基化以获得水性负载介质；

(iii):将步骤(ii)的负载介质施加到固相上，所述固相包含固体底基质，所述固体底基质含有包含疏水部分和/或正电性部分的配体，以便获得所述目的多肽到所述配体上的吸附；

(iv):从所述固相上洗脱所述目的多肽以便回收所述目的多肽，因此获得经过纯化的目的多肽；

其中与同样执行的用于纯化所述目的多肽的不包括步骤(ii)的比较方法相比，在步骤(iv)中获得的经过纯化的目的多肽的量(分子数)增加了至少5％。

2.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(ii)中添加糖苷酶。

3.根据权利要求1所述的方法，其中在权利要求1的步骤(ii)中添加糖苷酶是通过体外添加活性糖苷酶来进行。

4.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中与同样执行的用于纯化所述目的多肽的不包括步骤(ii)的比较方法相比，在步骤(iv)中获得的所述目的多肽的量(分子数)增加了至少50％。

5.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述目的多肽是目的蛋白质。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述目的蛋白质是目的酶。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述目的酶是目的牛奶凝固酶。

8.根据权利要求6所述的方法，其中所述目的牛奶凝固酶是选自由以下各项组成的群组的牛奶凝固酶：凝乳酶(EC3.4.23.4)、胃蛋白酶(EC3.4.23.1)和毛霉胃蛋白酶(EC3.4.23.23)。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述目的牛奶凝固酶是：

来源于米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)的毛霉胃蛋白酶；或

凝乳酶，其中所述凝乳酶的多肽序列包含与SEQIDNO:1(骆驼凝乳酶)的成熟多肽具有至少90％序列同一性的序列，所述成熟多肽是从SEQIDNO:1的氨基酸位置59到氨基酸位置381。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述目的牛奶凝固酶是凝乳酶，其中所述凝乳酶的多肽序列包含与SEQIDNO:1(骆驼凝乳酶)的成熟多肽具有至少99％序列同一性的序列，所述成熟多肽是从SEQIDNO:1的氨基酸位置59到氨基酸位置381。

11.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中权利要求1的步骤(i)中需要的由包括糖基化形式的目的多肽/蛋白质的许多组分组成的样品通过在真核生产宿主细胞中生产(例如重组生产)目的多肽或蛋白质来获得。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述真核生产宿主细胞是曲霉(Aspergillus)细胞，优选地是黑曲霉(Aspergillusniger)或米曲霉(Aspergillusoryzae)。

13.根据权利要求11所述的方法，其中所述目的蛋白质是目的牛奶凝固酶，并且所述目的牛奶凝固酶是：

来源于米黑根毛霉的毛霉胃蛋白酶，并且所述真核生产宿主细胞是米黑根毛霉；或

凝乳酶，其中所述凝乳酶的多肽序列包含与SEQIDNO:1(骆驼凝乳酶)的成熟多肽具有至少90％序列同一性的序列，所述成熟多肽是从SEQIDNO:1的氨基酸位置59到氨基酸位置381，并且所述真核生产宿主细胞是曲霉细胞，优选地是黑曲霉或米曲霉。

14.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中在步骤(ii)中使用的糖苷酶是N连接型糖苷酶。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述N连接型糖苷酶是选自由以下各项组成的群组的至少一种糖苷酶：肽-N(4)-(N-乙酰基-β-葡糖胺基)天门冬酰胺酰胺酶(EC编号：3.5.1.52；别称：N-糖苷酶-F或PNGase-F)和内切-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶H(EC编号：3.2.1.96；别称ENDO-H)。