[发明专利]经由去糖基化步骤对蛋白质的改良纯化

说明书

技术领域

本发明涉及一种使用去糖基化步骤纯化目的多肽的方法。

背景技术

蛋白质纯化方案通常包括一个或多个色谱步骤。色谱中的程序的一个实例是使含有蛋白质的溶液流过装填有各种材料的柱。不同的蛋白质与柱材料不同地相互作用，并且因此可以由通过柱所需要的时间或从柱上洗脱蛋白质所需要的条件来分离。

色谱是用于分离混合物的一组实验室技术的集合术语。使混合物溶解于被称为流动相的流体中，所述流动相携带混合物通过容纳被称为固定相的另一种材料的结构。混合物的各种组分以不同的速度行进，引起它们分离。分离是基于流动相与固定相之间的差分分配(differentialpartitioning)。化合物的分配系数的细微差别导致在固定相上的差分滞留并且因此改变分离。

存在许多不同的色谱方法。

疏水作用色谱(HIC)是基于包含疏水区的配体(例如苄基)。配体的疏水部分吸引蛋白质上的疏水区，并且蛋白质上的疏水区越大，配体与该特定蛋白质之间的吸引力就越强。

离子交换色谱根据化合物的离子电荷的本质和程度分离化合物。将要使用的柱是根据电荷的类型和强度来选择。阴离子交换树脂具有正电荷(例如胺)并且被用于保留和分离负电性的化合物，而阳离子交换树脂具有负电荷(例如羧酸盐基团)并且被用于分离正电性的分子。

如所属领域中已知的，混合模式色谱(MMC)或多元色谱是指利用固定相与分析物之间超过一种形式的相互作用以便实现其分离的色谱方法。其与常规单一模式色谱的不同之处在于，MMC中的次要相互作用不能太弱，并且因此其也有助于溶质的保留。

作为MMC的实例，配体例如可以是苄胺，其中苄基可被视作疏水部分并且胺可被视作正电荷部分(即，用于例如阴离子交换)。

蛋白质的糖基化是真核生物中常用的翻译后修饰。糖基化可以是N连接型(连接到Asn上)或O连接型(连接到Ser或Thr上)。糖基化对酶的作用可以影响其许多特性，例如溶解度、疏水性等，并且相反的作用(所谓的去糖基化)也会影响蛋白质特性。

如所属领域中已知的，术语“糖苷酶”(也称作糖苷水解酶)是指催化糖苷键结/键的水解的酶，糖苷酶在本文中也被称为去糖基化酶。

牛奶凝固酶(例如凝乳酶和胃蛋白酶)使牛奶发生酶促凝固是乳酪制造中最重要的过程中的一个。酶促牛奶凝固是两阶段工艺：在第一阶段中，蛋白水解酶、凝乳酶或胃蛋白酶攻击κ-酪蛋白，导致酪蛋白胶束结构的亚稳态，和在第二阶段中，牛奶随后凝固并且形成凝固物。

凝乳酶(EC3.4.23.4)和胃蛋白酶(EC3.4.23.1)(哺乳动物胃的牛奶凝固酶)是属于一大类肽酶的天冬氨酸蛋白酶。

WO01/58924A2(UpfrontChromatographyA/S,丹麦)描述使用混合模式配体苄胺对牛奶凝固酶(例如凝乳酶)进行色谱纯化。

WO01/58924A2没有描述在纯化过程中在目的蛋白质吸附/结合到配体上之前，与目的蛋白质的去糖基化有关的本文显著相关性的任何内容。

发明内容

本发明要解决的一个问题是提供一种用于纯化目的多肽的新颖方法，其中能够获得增加量的目的多肽(分子数)。

如本文中所讨论的并且不希望受限于理论，本文中相关的重要技术教导内容涉及本发明的发明人已经确定，通过对目的糖蛋白进行适当去糖基化，目的糖蛋白可以获得对包含疏水部分和/或正电性部分的配体的更好/更高结合能力。

因此，去糖基化步骤是本领域技术人员执行的常规步骤，本领域技术人员知晓许多不同的糖苷酶并且知晓如何将合适的糖苷酶添加到样品中以便获得目的多肽/蛋白质的本文相关去糖基化。

此外，本领域技术人员知晓许多不同的本文相关配体(参见例如综述文章：Yang等人,JournalofChromatographyA,1218(2011)8813-8825)。

本领域技术人员知晓许多本文中相关的纯化/分离技术，其是基于目的蛋白质被吸附/结合到配体上，实例是例如柱色谱、膨胀床色谱(EBA)、离子交换色谱等。

在工作实例中，在本文中可以看到两种结构不同的酶(来源于米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)的毛霉胃蛋白酶(mucorpepsin)和骆驼凝乳酶)的去糖基化获得了对苄胺配体(即可被视作包含疏水部分(苄基)和正电性部分(胺)的配体)的显著更好的结合能力。