[发明专利]用于产生稳定转染细胞的方法和组合物

权利要求书

1.用于产生表达外源多肽之稳定CHO细胞系的方法，其包括：

使用流式电穿孔将浓度为400μg/mL以上的表达构建体转染进细胞中，其中所述表达构建体包含i)可选择的基因和ii)编码外源多肽的序列；

在包含G418的条件致死浓度为1.6mg/ml的培养条件下对选择基因的表达进行选择，其中将所述细胞培养两周。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述表达构建体是细菌质粒、病毒载体、黏粒或人工染色体。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述表达构建体为环状。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述表达构建体为线形。

5.根据权利要求2所述的方法，其中所述表达构建体是细菌质粒。

6.根据权利要求1所述的方法，其中将所述表达构建体转染进细胞中包括使所述细胞的悬浮液流过流动室中的电场，所述电场由至少部分地限定了流动室的相对的带相反电荷的电极产生，其中所述流动室的热阻小于10℃每瓦特。

7.根据权利要求1所述的方法，其中转染所述细胞包括采用流式电穿孔装置，所述装置包含用于容纳待电穿孔细胞之悬浮液的室；所述室至少部分地由相对的带相反电荷的电极限定；并且其中所述室的热阻小于10℃每瓦特。

8.根据权利要求1所述的方法，其中转染所述细胞包括采用流式电穿孔装置，所述装置包含：限定流道的壁，所述流道具有被配置为接收和暂时容纳待电穿孔细胞的悬浮液之持续流的电穿孔区域；与所述流道流体连通的流入口，由此可通过所述流入口将所述悬浮液引入至所述流道中；与所述流道流体连通的流出口，由此可通过所述出口将所述悬浮液从所述流道排出；在电穿孔区域内限定所述流道的壁，包含形成所述流道之第一壁的主要部分的第一电极和形成与所述第一壁相对的所述流道之第二壁的主要部分的第二电极，所述第一电极和第二电极是这样的，当将所述第一电极和第二电极与电能来源电连通时，在所述电极间形成所述悬浮液可流过的电场；并且其中所述流道的热阻小于10℃每瓦特。

9.权利要求8所述的方法，其中所述第一电极和第二电极彼此间隔至少1mm。

10.根据权利要求8所述的方法，其中所述流动室与缓冲液接触的合并电极表面与电极之间距离的比为1比100cm。

11.根据权利要求8所述的方法，其中在所述流道中电穿孔的所述细胞不会因此被热降解。

12.根据权利要求7或8所述的方法，其中所述流式电穿孔装置包含用于容纳待电穿孔细胞之悬浮液的流动室；所述流动室至少部分地由相对的带相反电荷的电极限定；并且其中所述流动室与缓冲液接触的合并电极表面与电极之间距离的比为1比100cm。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述比为1比70cm。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述比为1比50cm。

15.根据权利要求8所述的方法，其中所述流道的热阻为0.1℃每瓦特至10℃每瓦特。

16.根据权利要求9所述的方法，其中所述第一电极和第二电极彼此间隔至少3mm。

17.根据权利要求8所述的方法，其中所述流动室与缓冲液接触的合并电极表面与电极之间距离的比为1比100cm，并且其中所述第一电极和第二电极彼此间隔至少1mm。